右旋糖酐蔗糖酶純化及生產應用的研究進展

徐欣東，王清，齊鵬翔，黃雙霞，梁欣泉

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004；2.糖業及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004)

在白砂糖的生產中，常常由于受到菌種感染而形成影響糖品質量的“蔗飯”，其本質是具有一定分子量的葡聚糖，又稱右旋糖酐(dextran)。充分利用右旋糖酐對糖品深加工及綜合利用具有實際產業意義，受到國內外學者的廣泛關注。

目前，右旋糖酐的酶法合成主要采用右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase)作為合成酶，其為GH70家族的一種葡萄糖基轉移酶，該酶能夠以蔗糖為底物，在適宜的條件下聚合生成右旋糖酐[1]。此外，右旋糖酐蔗糖酶還可用于葡萄糖苷的合成，以及借助基因工程、雙酶聯用等技術實現低聚葡萄糖的合成。酶合成法相較目前工業上普遍采用的菌種發酵法，在產物分離純化、產物產率、連續生產等方面具有優勢。因此，對右旋糖酐蔗糖酶的深入研究將有助于揭示酶的反應機理，提升酶法合成的整體效率。文章綜述了右旋糖酐蔗糖酶的反應機理、純化手段、生產改造及應用等幾個方面的研究進展，對右旋糖酐蔗糖酶與其他先進技術的交叉應用及未來發展進行了闡述和展望。

1 右旋糖酐蔗糖酶的反應機理

右旋糖酐蔗糖酶分子由1250～1600個氨基酸組成，其編碼基因大致可分為以下4個區域：A區域為信號肽段，B區域為機動可變區，C區域具有結合和切斷蔗糖中葡萄糖和果糖分子及轉移糖基的功能，D區域具有連接右旋糖酐鏈的功能。此外，有學者對右旋糖酐蔗糖酶的氨基酸序列進行了定點突變，發現Asp-511和Asp-551的突變完全抑制了合成右旋糖酐和寡糖的活性，表明至少有兩個羧基對催化過程至關重要；然而酶結合右旋糖酐鏈的活性卻未因突變而喪失，表明右旋糖酐蔗糖酶具有與其他葡糖基轉移酶一樣的雙結構域結構[2]。右旋糖酐蔗糖酶的三維結構圖見圖1。

圖1 右旋糖酐蔗糖酶的三維結構圖Fig.1 Three-dimensional structure drawing of dextransucrase

一般認為，右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖生成右旋糖酐和果糖的反應可分為分離和連接兩個步驟[3]，見圖2。因此其反應機理可大致分為以下幾個過程：(1)葡萄糖基的分離，之后形成葡萄糖基-酶復合物，最后轉移到右旋糖酐主鏈或者支鏈上；(2)果糖釋放，這也是測定酶活力的重要依據；(3)右旋糖酐鏈整條作為支鏈連接至另一條鏈上。對于右旋糖酐鏈聚合反應終止的原因，可能是由右旋糖酐鏈與其他受體結合或者空間受限引起的。

圖2 右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐的反應機理Fig.2 The reaction mechanism of dextran synthesized by dextransucrase

注：圖中○表示葡萄糖，△表示果糖，X1和X2表示右旋糖酐蔗糖酶的親核部分。

2 右旋糖酐蔗糖酶的酶學性質及純化

2.1 酶學性質

右旋糖酐蔗糖酶的分子量約為170 kDa，其pI值和米氏常數(Km)通常為4.1和12～16 mmol/L。該酶在純化后，其最適pH為5.0～5.5，最適溫度為30 ℃，其僅能通過分解蔗糖生成右旋糖酐，葡萄糖、蔗糖與葡萄糖的混合物以及其他自然糖都不能作為底物進行生產[4]。在酶的激活方面， Ul-Qader等[5]研究發現當CaCl2的濃度為0.005%時，酶活力提升至108.26 DSU/mL/h，與對照組相比提升了2.03倍；同時也發現添加0.010% CaCl2時，培養液內的總蛋白含量較0.005%時高，但酶活力下降。由此可見，當Ca2+在一定濃度范圍內時，Ca2+會優先與酶上的激活位點結合，且激活作用強于抑制作用。

2.2 純化方法

從腸膜明串珠菌菌種中生產的右旋糖酐蔗糖酶為胞外酶，相比于其他具有相同作用的胞內酶，該酶具有易分離和純化的優勢。此外，右旋糖酐蔗糖酶屬于蛋白酶，可根據蛋白質的溶解度、分子大小、帶電性質、配體特異性等差異來進行純化分離，因此在純化方法上主要有兩相分配法、物理過濾法、離子交換法、親和層析法等。

2.2.1 兩相分配法

兩相分配法利用兩相之間對待分離分子的溶解度差異來實現分離，其實質是待分離分子在兩相間達到溶解平衡的過程。Nigam等[6]比較了聚乙二醇PEG6000與PEG400對右旋糖酐蔗糖酶的相分離純化效果，結果表明PEG6000的三級相分離效果更優，最終回收率為84%，且純化后的酶比活性及右旋糖酐產率均較高。Paul等[7]采用右旋糖酐和PEG之間的兩相分配法對右旋糖酐蔗糖酶進行了純化，與凝膠過濾及超濾純化方法相比，兩相分配法的酶回收率為95%，比活性大于3500 DSU/mg，均優于兩種過濾法。

2.2.2 物理過濾法

物理過濾法主要是通過蛋白質分子大小差異來對酶進行分離，其中常用的方法有透析法、超濾法、分子篩法(凝膠過濾法)等。Baruah等[8]采用基于PEG的離心透析純化法，該法以物理分離為主要思路，能較好地保留酶的原始性質。Kaboli等[9]在對酶進行固定化前采用超濾與凝膠過濾聯用的方法對游離右旋糖酐蔗糖酶進行了純化，最后得到的酶回收率為54.2%，比活性則為34.3 U/mg。

2.2.3 離子交換法

由于蛋白質帶有一定的電荷性質，因此可用電荷性質相反的離子交換劑吸附蛋白質，隨后通過調節pH或離子強度的方式使其洗脫，以達到分離純化的效果。Ghai等[10]在用硫酸銨對粗酶液進行分級沉淀后，將沉淀物溶解并用DEAE-纖維素陰離子交換層析對酶進行純化，層析后得到3種右旋糖酐蔗糖酶異構體，純化倍數分別為6.02，5.95，8.55。Guzman等[11]采用固定化酶法對酶進行純化，首先將右旋糖酐蔗糖酶固定于右旋糖酐鏈上，經過濾濃縮后再使用右旋糖酐酶對右旋糖酐-酶復合物進行分解，最后用陰離子交換色譜法進行分離，該法使用酶反應產物作為載體來轉移目標酶，為基于離子交換法提供了一種新的思路。

2.2.4 親和層析法

親和層析法是指利用與待分離蛋白質分子具有特異可逆連接的配體來進行分離純化的方法，具有較高的特異純化效果，也可對特定蛋白質進行特異性識別。Miller等[12]使用基于離子交換、親和層析及與右旋糖酐酶聯用的方法來進行純化，該法的純化效果較好，并發現存在兩種分子量的右旋糖酐蔗糖酶(177，158 kDa)，同時研究了兩種酶在儲藏期間的含量變化關系，為酶純化后的儲存方法提供了參考。Moulis等[13]將右旋糖酐蔗糖酶中dsrS截短片段的重組蛋白與Ni-NTA樹脂進行親和層析，產率為45%，所得的重組dsrS酶具有優良的酶促專一性。

3 右旋糖酐蔗糖酶的生產及改造

3.1 生產優化

3.2 基因改造

隨著近些年基因工程的快速發展，出現了采用異源表達法來進行右旋糖酐蔗糖酶改造的研究，這對酶合成的糖苷鍵、酶活性、產物產率等指標都有重要提升，是目前較為熱門的酶改造方法。李秋萍[17]從增強右旋糖酐蔗糖酶的轉糖基功能的角度入手，從分子層面對酶進行改造，使突變后的DSR酶具有比原酶更高的轉糖基活性。Wang等[18]基于dsrYG基因構建了誘變右旋糖酐蔗糖酶，突變酶所表達的右旋糖酐含有0%～52%的α(1，4)糖苷鍵，與原酶產物結構有較大差異，該突變酶在合成超支化右旋糖酐方面存在較大潛力。Kang等[19]針對dsrE563基因進行了截短表達，其中發現GBD-CD2重組酶專門負責生成α(1，2)糖苷鍵，這從基因角度確定了右旋糖酐蔗糖酶上生成支鏈的活性位點。

得益于基因工程的定點截短及突變能力，可對右旋糖酐蔗糖酶所合成糖苷鍵的類型、異源表達載體、轉糖基功能等方面進行深入研究，這將有助于探索開發支化右旋糖酐等產物。

4 右旋糖酐蔗糖酶的應用

4.1 合成右旋糖酐

右旋糖酐(dextran)是一種由若干分子的葡萄糖經過脫水連接形成的無毒無害的高聚均多糖，其在醫藥、食品、化妝品等領域有著廣泛的應用。其中，高分子量右旋糖酐(Mw>106Da)可作為色譜柱填充劑；中分子量右旋糖酐(105Da

目前工業生產右旋糖酐的主要方式為菌種發酵，但該法存在操作復雜、試劑消耗大等問題。酶法合成具有顯著的產物專一性，且右旋糖酐蔗糖酶具有底物特異性，因此該法在產物純度及提純難度上均優于發酵法，減少了大量試劑的使用，具有一定的生產優勢[22]。Kim等[23]對利用右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐作了相關研究，發現當底物中蔗糖含量為4%、溫度為25 ℃時，產物中小分子量及高分子量右旋糖酐的占比較高。Goulas等[24,25]構建了右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的雙酶體系，研究發現通過此法可調節右旋糖酐的分子量，且當蔗糖濃度及右旋糖酐酶酶量增大時，產物中低分子量右旋糖酐的產量會上升；此外，其還以雙酶體系為基礎，制備了一個基于超濾膜技術的膜生物反應，在反應體系中加入兩種酶，并將反應液通過切割分子量為10 kDa的超濾膜，將酶進行截留并回流至反應體系中，而產物和果糖等單糖則透過膜進行分離；該法在酶的循環利用和產物-酶分離上具有較好的優勢，但還存在膜易堵塞、成本較高等問題。

由此可見，目前右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶聯用法可以實現定向制備特定分子量右旋糖酐[26]，基于此理論體系，可以再結合膜分離、固定化酶等技術對生產效率及實際可行性進行進一步優化。

4.2 合成低聚葡萄糖

低聚糖作為一種新型功能性多糖，廣泛應用于食品、保健品、醫藥等領域，是一種具有良好研究前景的產品[27]。在酶法合成右旋糖酐中，產物分子量普遍在106Da以上，通過雙酶聯用法或融合酶法可有效降低產物分子量，以實現低聚葡萄糖的合成。Gan等[28]使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐分解酶協同催化的方法制得了分子量為6587 Da的低聚糖，并通過紅外光譜及核磁共振表征結果推論該低聚糖由35個α(1，6)糖苷鍵和1個由α(1，3)糖苷鍵連接的葡萄糖殘基組成，驗證了雙酶法合成低聚葡萄糖的可行性。Hou等[29]設計了一種基于雙酶法的循環超濾膜生物反應器，該裝置在0.8 mol/L蔗糖、30 h反應時間的條件下，Mw<104Da的右旋糖酐占比為60.19%，為低聚葡萄糖的批量生產提供了參考。Kim等[30]將兩種酶進行融合以應用于低聚葡萄糖的生產，實際研究中發現融合酶法生產低聚糖的產量是同活性下雙酶法的30倍。由此可見，低聚葡萄糖可通過工程酶法和雙酶法進行合成，如能對低聚糖產物的結構及功能進行表征，則可進一步驗證該工藝的生產意義。

4.3 合成葡萄糖苷

由于右旋糖酐蔗糖酶具有轉糖基功能，因此有學者以此酶為工具來對特定葡萄糖苷的合成進行研究。Nam等[31]利用來自于腸膜明串珠菌的右旋糖酐蔗糖酶來酶促修飾咖啡酸，經表征后確定合成產物為咖啡酸葡萄糖苷，其相較于咖啡酸，水溶性提升3倍，抗脂質過氧化作用提升1.66倍，抗癌細胞生長作用提升15%，可作為食品或藥品的適宜成分。Seo等[32]采用右旋糖酐蔗糖酶酶促合成對苯二酚葡萄糖苷，其得到的產物的抗氧化性及亞硝酸鹽清除活性均高于β-熊果苷。由此可見，對于具有酚羥基及醇羥基的部分有機物，可通過右旋糖酐蔗糖酶的轉糖基功能來合成相應的葡萄糖苷，而這種糖苷反應對目前多種調味品成分的構建具有重要指導意義[33,34]。

5 總結與展望

上述研究表明，通過右旋糖酐蔗糖酶催化反應及酶基因改造，可以以蔗糖為原料合成具有更多應用、更高經濟價值的右旋糖酐、低聚糖、葡萄糖苷等產物，為蔗糖深加工提供了一條新的路線。從技術強化角度來看，已經能夠將右旋糖酐蔗糖酶與基因工程、膜技術等當今熱門研究技術相結合，增強或改變右旋糖酐蔗糖酶的特定功能，從而開發出融合酶、酶膜反應器等新產品，進而以此為工具生產更多的高值化物質。

在右旋糖酐蔗糖酶所引發的糖苷化反應方面，目前還缺少糖苷化反應中酶對底物特異性識別的相關機理研究，如能對該方面進行進一步研究，就可從聚合角度對右旋糖酐的改性有更深入的了解，進而實現利用改性單體進行糖苷化聚合形成改性右旋糖酐，以擴展右旋糖酐蔗糖酶的應用潛力。