高效液相雙柱法測定油脂中的甘油三酯氧化聚合物

鄧 琪，袁仲安，黃雪松

（暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632）

油脂在高溫下會發(fā)生氧化[1]、水解[2]、聚合[3]等熱質(zhì)變反應(yīng)，產(chǎn)生比甘油三酯極性大的極性部分（polar components，PC）[4]，包括甘油三酯氧化寡聚物（oxidized oligomeric triacylglycerols，TGO）、甘油三酯氧化二聚物（oxidized dimeric triacylglycerols，TGD）、甘油三酯氧化單體（oxidized monomeric triacylglycerols，ox-TGM）[5]、甘油二酯（diacylglycerols，DG）以及游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）等組分。其中TGO和TGD是甘油三酯熱氧化聚合產(chǎn)物[6]，ox-TGM是熱氧化產(chǎn)物，DG、單甘酯（monoacylglycerols，MG）以及FFA為熱水解產(chǎn)物。高溫條件下，甘油三酯也發(fā)生熱聚合反應(yīng)產(chǎn)生僅通過Cü C鍵聚合的非極性（nonpolar components，Non-PC）甘油三酯聚合物[7]。油脂中PC組分含量的高低是目前評價煎炸油氧化程度的最佳指標(biāo)，其中甘油三酯氧化聚合物（oxidized triacylglycerol polymers，TGP）的含量在油脂精煉過程中“只增不減”[8-9]，是一類難以去除的、反映熱處理程度與存放時間長短的特征性內(nèi)源性熱氧化聚合產(chǎn)物，因此利用TGP含量高低甄別煎炸油脂[10]、劣質(zhì)油脂、過期油脂、新鮮油脂等，有助于鑒偽食用油脂[11]、評價油脂氧化程 度[12-13]、油脂質(zhì)量控制[14-15]等方面。

目前檢測油脂中TGP含量的標(biāo)準(zhǔn)方法包括ISO方法[16]和AOCS方法[17]，但這2 種方法不能把油脂中極性的熱氧化聚合產(chǎn)物和非極性的熱聚合產(chǎn)物分開，且只適用于TGP含量高于3%的油脂。為解決這些問題，又出現(xiàn)不少改進方法，包括硅膠柱層析（silica columns，SC）-體積排阻色譜（high-performance size-exclusion chromatography，HPSEC）法[18-19]、小型硅膠柱層析（silica minicolumns，SMC）-HPSEC法[20-21]、固相萃取（solid-phase extraction，SPE）-HPSEC法[22]、制備型快速柱層析（preparative flash chromatography，PFC）-HPSEC法[23]等，其共同點是采用硅膠等吸附材料預(yù)先吸附PC、洗脫（即吸附色譜）分離Non-PC后，再通過體積排阻色譜柱，依據(jù)分子質(zhì)量大小分離PC中的TGO、TGD、ox-TGM、DG、FFA。但在使用硅膠柱、小型硅膠柱、固相萃取預(yù)分離PC時，必然會有一定程度的樣品丟失、增加氧化反應(yīng)、增加操作誤差等而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，這些預(yù)分離措施需要相應(yīng)的儀器、試劑，也存在增加操作時間等弊端[24]。為此，本實驗擬采用“雙柱法”直接測定TGP，即將正向硅膠柱與凝膠柱先后串聯(lián)，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定時直接進樣，再經(jīng)梯度洗脫準(zhǔn)確、快速、方便地測定TGO、TGD、ox-TGM、DG、FFA等PC組分。此方法無需預(yù)分離步驟且能夠快速、簡便、準(zhǔn)確測定油脂中TGP的含量，有益于控制、評價油脂的質(zhì)量與安全。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

自制廢棄食用植物油樣品：橄欖油、花生油、澳洲堅果油。

PC、Non-PC標(biāo)準(zhǔn)樣品 自制；四氫呋喃（色譜純）、石油醚（沸程60～90 ℃，色譜純） 克魯?shù)禄す煞萦邢薰荆籇L-1,2-二棕櫚精（標(biāo)準(zhǔn)品） 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；三油酸甘油酯（標(biāo)準(zhǔn)品） Alfa Aesar化學(xué)有限公司。

LC-20A nence HPLC儀（配有蒸發(fā)光散射檢測器） 日本島津公司；Luna Silica(2)色譜柱（250 mmh 4.6 mm，5 μm）、PhenogelTM體積排阻凝膠色譜柱（300 mmh 7.8 mm，5 μm，100 ?） 美國Phenomenex公司；薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）板 德國Merck公司；X500 QTOF高分辨質(zhì)譜系統(tǒng) 美國Sciex公司。

1.2 方法

1.2.1 配制聚合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液

按照GB 5009.202ü 2016《食用植物油煎炸過程中的極性組分（PC）的測定》[25]中第二法分離制備PC部分和Non-PC部分[26]。為考察線性范圍、檢出限以及定量限，準(zhǔn)確稱取200 mg PC樣品，用10 mL四氫呋喃溶成20 000 mg/L的PC標(biāo)準(zhǔn)母液，連續(xù)稀釋配成PC質(zhì)量濃度分別為5 000、4 000、3 333、2 500、2 000、1 666、1 250、625、312、267、234、208、187、156、78、39、20、10 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品上樣液，HPLC測定后，外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 外標(biāo)法樣品配制以及加標(biāo)DG樣品制備

制備一系列質(zhì)量濃度分別為4 320、3 600、2 700、1 350、675、338、169 mg/L的DG標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個質(zhì)量濃度連續(xù)進樣3 次，制作外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測定10 000 mg/L的PC標(biāo)準(zhǔn)溶液中DG的含量作為本底值，用微量移液器分別移取60 μL質(zhì)量濃度分別為675、1 350、2 700 mg/L的DG標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入60 μL PC標(biāo)準(zhǔn)溶液（已知其中DG的質(zhì)量濃度）中作為加標(biāo)樣品，平行制備3 份，用于考察雙柱法的回收率。

1.2.3 TLC分離油脂中的PC和Non-PC部分測定

依照GB 5009.202ü 2016附錄C中PC和Non-PC分離效果的TLC驗證法，將其中TLC展開劑改為石油醚、四氫呋喃，改變石油醚和四氫呋喃的比例分別為0∶100、5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、30∶70、40∶60、70∶30、80∶20、100∶0，驗證PC和Non-PC的分離效果，大致確定HPLC測定程序，TLC展開劑的比例如表1所示。

表 1 雙柱法測試程序方法Table 1 Elution program for HPLC with two tandem columns

1.2.4 HPLC梯度洗脫方法設(shè)計

根據(jù)TLC分離結(jié)果，設(shè)計HPLC洗脫方法1，并進行HPLC測試，然后根據(jù)方法1的測試結(jié)果進行方法調(diào)整，得到表1中的一系列洗脫方法。測試樣品PC質(zhì)量濃度為5 000 mg/L，Non-PC質(zhì)量濃度為22 000 mg/L。

1.2.5 HPLC分析條件

將Phenomenex Luna Silica(2)色譜柱（250 mmh 4.6 mm，5 μm）和PhenogelTM體積排阻凝膠色譜柱（300 mmh 7.8 mm，5 μm，100 ?）先后串聯(lián)，進樣量7 μL，流速0.7 mL/min，流動相為四氫呋喃和石油醚，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，檢測器以干燥潔凈的壓縮空氣為霧化氣體，壓力0.5 MPa，氣體流速2.4 L/min，漂移管溫度90 ℃，增益值1。

梯度洗脫條件：流動相分別為石油醚（A）和四氫呋喃（B）；梯度洗脫程序為0 min、5% B，20 min、15% B，30 min、30% B，35 min、5% B；流速 0.7 mL/min；測定時間50 min。

1.2.6 質(zhì)譜定性檢測TGP條件

按1.2.5節(jié)方法對自制PC標(biāo)準(zhǔn)樣品進行HPLC測定，記錄每個峰的出峰時間，收集每個流出峰進行質(zhì)譜測定（由于35 min后第1個峰的起止時間太短，將第1個峰和第2個峰一起接出）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；氣簾氣壓力30 psi；離子化電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；電噴霧氣壓力50 psi；輔助加熱氣壓力60 psi；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～5 000。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

油脂各組分的HPLC色譜圖以及多組色譜疊加圖由島津的Labsoluton軟件處理生成，雙柱法的回收率、重復(fù)性、誤差、工作曲線，以及相關(guān)表格的數(shù)據(jù)處理，均采用Excel 2016軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙柱法測定條件的確定

2.1.1 TLC確定適宜展開劑

從左到右四氫呋喃與石油醚-乙酸體積比分別為0∶100∶2、5∶95∶2、10∶90∶2、15∶85∶2、20∶80∶2、30∶70∶2、40∶60∶2、60∶40∶2、70∶30∶2、80∶20∶2、100∶0∶2。1. PC；2. Non-PC；3.樣品油。

從圖1可看出，當(dāng)四氫呋喃體積分數(shù)高于30%時，PC與前沿的Non-PC未分開，其Rf值約為1；當(dāng)四氫呋喃體積分數(shù)低于30%時，PC能與Non-PC分開，但PC和Non-PC部分連在一起，但若在HPLC儀分析時采用選擇梯度洗脫，兩者分離效果應(yīng)該能夠改善。根據(jù)TLC分離效果最好在Rf約為0.3的原則[27]，故將洗脫程序從5%的四氫呋喃開始，在20 min內(nèi)，四氫呋喃的體積分數(shù)逐漸升到15%，使PC和Non-PC快速分開，但為了防止PC出峰時間太晚，快速將四氫呋喃的體積分數(shù)在5 min內(nèi)提升到30%，最后在5 min內(nèi)把四氫呋喃的體積分數(shù)降回5%（表1方法1）。

2.1.2 洗脫方法的選擇

圖 2 洗脫方法對比色譜圖Fig. 2 Comparison of several elution methods

如圖2A、B所示，洗脫的總時間達到50 min，但PC和Non-PC之間的時間間隔接近20 min，由此考慮有可能總的檢測時間可以達到更短，所以優(yōu)化得到其他方法。如圖2C所示，方法3的時間有所縮短，但對比分離度方 法1更高。其余方法沒有有效的分離效果，如圖2D所示。因此最終采用方法1作為最終的方法；但從實際效果看，最優(yōu)條件仍有待進一步優(yōu)化。

2.2 PC各組分的定性

雖然檢測油脂中TGP含量的標(biāo)準(zhǔn)方法包括ISO方法[5]和AOCS方法[6]，都對PC各組分的定性有具體規(guī)定，但由于雙柱法受柱子吸附、分子篩雙因素的影響，其定性規(guī)律應(yīng)當(dāng)與這些方法有所不同。因此，有必要對雙柱法的各峰進行定性。

2.2.1 DG的確定

如圖3A所示，外標(biāo)物DG保留時間為42.719 min，對比PC樣品（圖3B）中第4個峰，兩峰的保留時間一致，根據(jù)保留時間一致、物質(zhì)性質(zhì)一致的定性原則[28]，確定圖3B中第4個峰為DG。

圖 3 PC組分定性色譜圖Fig. 3 Qualitative chromatograms of polar components

2.2.2 TGO與TGD的確定

35 min后第1峰與第2個峰分子質(zhì)量分布在900～2 200 Da之間，由于TGO、TGD分別比ox-TGM單體平均相對分子質(zhì)量的3 倍小180～225 Da、2 倍小80～105 Da[29]，且TGO的分子質(zhì)量（其分子質(zhì)量約為2 300～2 500 Da）比較大，在凝膠柱上應(yīng)該早于TGD出現(xiàn)（其分子質(zhì)量約為1 500～1 800 Da），由此兩點判斷出圖3B中35 min后的第1個峰為TGO，保留時間為39.355 min，第2個峰為TGD，保留時間為40.043 min。

2.2.3 ox-TGM的確定

35 min后出現(xiàn)的第3個峰分子質(zhì)量在700～1 300 Da之間，其中分子質(zhì)量在800～1 000 Da的比較多，與ox-TGM的分子質(zhì)量（其分子質(zhì)量約為800～1 000 Da）范圍一致。此外，ox-TGM的極性比DG小，所以其出峰時間應(yīng)早于DG（在正相柱上，極性強的出峰遲），且ox-TGM的分子質(zhì)量也比TGP小，所以應(yīng)在TGP后出峰。根據(jù)這兩點可以推斷出圖3B中第3個峰為ox-TGM，保留時間為41.004 min。

由上述分析可知，本雙柱法PC出峰的順序依次為TGO、TGD、ox-TGM、DG，本實驗條件下，其保留時間依次為39.355、40.403、41.004、42.719 min，與標(biāo)準(zhǔn)方法（ISO方法、AOCS方法、IUPAC方法）的出峰順序一致。

2.3 PC各組分的定量

2.3.1 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)雙柱法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.29x2＋2 046x－204 904，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 4（P＜0.01，顯著相關(guān)）。

2.3.2 雙柱法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、檢出限和定量限結(jié)果

以TGP的峰面積為縱坐標(biāo)，PC組分標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.484 4x2＋848.95x－352 438，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)PC組分溶液，信噪比為3時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為檢出限，信噪比為10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限。本方法TGD的檢出限為156 mg/L，定量限為267 mg/L。

2.3.3 雙柱法的精確度與回收率結(jié)果

表 2 雙柱法分離油脂DG的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries and RSDs of DG spiked samples

對3 個質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)DG樣品（理論質(zhì)量濃度分別為479、817 mg/L和1 492 mg/L）進行回收實驗，如表2所示，DG的回收率在95%～99%之間，3 個平行樣品之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于2%。

2.3.4 雙柱法測定TGP的重復(fù)性結(jié)果

選用橄欖油、澳洲堅果油、花生油3 種廢棄植物油樣品，采用雙柱法測試，每個樣品分別連續(xù)進樣5 次。如表3所示，橄欖油、澳洲堅果油、花生油的RSD分別為2.266 5%、2.711 3%、2.344 1%，3 種廢棄油的RSD均小于3%，表明此方法的重復(fù)性良好。

表 3 雙柱法測定TGP的重復(fù)性Table 3 Repeatability of the developed method

2.4 雙柱法與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

雙柱法定量油脂中TGP含量的方法，與標(biāo)準(zhǔn)方法（ISO方法、AOCS方法[30]、IUPAC方法）相比，無與分離過程、用樣量少、節(jié)省時間、操作簡便，具有多方面的優(yōu)點。由表4可以看出，雙柱法除具有前述的準(zhǔn)確、快速、高效特點外，還具有節(jié)省時間、試材、設(shè)備等多方面的優(yōu)點。

表 4 各類分離方法對比Table 4 Comparison of advantages and disadvantages of various separation methods

3 結(jié) 論

建立雙柱法定量檢測油脂中TGP含量的方法，本方法無需預(yù)分離油脂中的PC，直接進樣即可，總測定時間為50 min，縮短了檢測時間，方法的精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系均滿足定性定量要求，適用于油脂中TGP的定量檢測。