大球蓋菇1 號的分離純化及其液體培養基優化*

柏秋月，鄧百萬,2**，解修超,2，寧 靜，常 寧

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723000）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata） 屬于擔子菌門（Basidomycota） 球蓋菇科（Strophariaceae）球蓋菇屬（Stropharia），又名皺球蓋菇、酒紅大球蓋菇等[1]。其色澤艷麗、腿粗蓋肥、食味清香，含有相當高的蛋白質和多種礦物質元素及維生素[2]。近年來研究發現，大球蓋菇在改善冠心病[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]、抑菌[6]等方面作用顯著，且其作為世界交易的十大菇品種之一，需求量大，因此受到國內外眾多學者的關注[7]。

近年來，我國食（藥） 用菌產業發展迅速，傳統的固體菌種由于培養周期長，生長緩慢，菌絲易老化，使得大球蓋菇的大規模生產受到一定的限制。而液體菌種具有生長周期短，生長快，菌種純度高，適合大規模生產等諸多優點[8]，更易于實現大球蓋菇工業化、標準化、周年化生產。但大球蓋菇的液體培養基菌體生長較慢，而目前對于食用菌的的培養基優化多采用單因素試驗，其存在試驗次數多、周期長和結果不準確等缺點[9]。因此，為提高試驗結果的準確信，減少試驗研究的工作量，研究以大球蓋菇1 號子實體作為材料進行分離純化，得到大球蓋菇菌株，并通過Plackett-Burman 設計試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken 響應面分析試驗對大球蓋菇液體培養基組成進行優化，確定最優培養基配方，使大球蓋菇1 號菌絲體在短期內生物量達到最大，彌補固體菌種在生產中的不足，以期為大球蓋菇1號液體種的工業化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試大球蓋菇于2019 年5 月采自陜西省漢中市南鄭縣，品種為大球蓋菇1 號，審定編號為川審菌2004 004。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺，上海蘇凈實業有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZRD-A7230 鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；FA2004 電子分析天平，上海精科天平有限公司；HWY-2112 型恒溫培養箱，中國廈門醫療電子儀器廠；HWY-2112 型搖床，廈門德維科技有限公司；K960 型熱循環PCR 儀，杭州晶格科學儀器有限公司；DYCZ-22A 型水平電泳儀，北京六一廠。

1.3 培養基

改良馬鈴薯培養基：土豆200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、磷酸二氫鉀5 g·L-1、硫酸鎂3 g·L-1、VB10.1 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

基礎培養基：蔗糖20 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、磷酸二氫鉀3 g·L-1、硫酸鎂2 g·L-1、玉米粉10 g·L-1、VB11 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

察式培養基：硝酸鈉3 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、氯化鉀0.5 g·L-1、硫酸亞鐵0.01 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

1.4 方法

1.4.1 菌種的分離純化

將大球蓋菇1 號子實體用無菌水沖洗干凈后，先在75%酒精溶液中浸泡30 s，用無菌水沖洗后置于0.1%升汞溶液中浸泡5 min，再用無菌水沖洗5次~6 次后用無菌濾紙吸干其表面的水，置于墊有滅菌濾紙的平皿上[10]。用解剖刀取菌蓋及菌柄與菌蓋交界處取約6 mm 菌肉接種至馬鈴薯培養基中，于28℃培養箱下培養，得到大球蓋菇1 號菌株004。

1.4.2 菌種形態鑒定及ITS 分子鑒定

將分離的大球蓋菇1 號菌株004 接于察氏培養基上，取其菌絲采用棉藍染色法在光學顯微鏡下對菌絲體的形態和大小進行鑒定[11]。

將分離的大球蓋菇菌絲體利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB 法） 提取DNA，并采用真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 進行擴增。PCR 反應體系（30 μL）：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmoL·L-1上、下游引物各1 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 補至30 μL。PCR 反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36 個循環；72℃延伸10 min。PCR 產物送上海生工生物工程有限公司測序[12]，將測得序列提交NCBI 數據庫進行Blast 同源比對，使用MEGA 7.0軟件分析，構建系統進化樹，確定菌株分類地位。

1.4.3 菌絲球干質量測定方法

取1.00 cm2的大球蓋菇1 號菌絲塊接種于150 mL 基礎液體培養基中，重復3 組，靜置24 h 后于28℃，140 r·min-1搖床發酵10 d，將發酵液抽濾后，置于干燥箱中60℃烘干水分后稱重，菌絲球干重（Y，g·150-1mL-1） 取平均值[13]。

1.4.4 Plackett-Burman 試驗

以蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、酵母膏（X3）、KH2PO4（X4）、MgSO4（X5）、玉米粉（X6）、VB1（X7） 等因素為研究對象，進行Plackett-Burman 試驗，按表1 和表3 配置液體培養基，每個處理設3個重復，菌絲球干重（Y） 取平均值，并采用Minitab 18 軟件對數據進行統計分析。

表1 Plackett-Burman 試驗設計表Tab.1 Plackett-Burman experimental design table

1.4.5 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman 試驗的設計分析影響菌株004 菌絲體干重的因素，將正效應顯著性因素逐步增加，負效應顯著因素逐步減少，進行最陡爬坡試驗，對于影響無統計學意義但使生物量升高的因素取“+1”水平，對于影響無統計學意義但使生物量降低的因素取“-1”水平[14]。

1.4.6 Box-Behnken 試驗設計

根據最陡爬坡試驗的結果，采用Box-Behnken中心復合實驗設計原理，選取MgSO4（X5）、玉米粉（X6）、VB1(X7) 3 個因素作為自變量，對每個自變量的低、中、高水平分別以-1、0、+1 進行3 因素3水平的試驗。每組實驗重復3 次，菌絲球干重（Y）取平均值，因素和水平編碼，如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗設計表Tab.2 Box-Behnken experimental design table

1.4.7 數據處理和分析

利用Minitab 18 軟件對Plackett-Burman 試驗結果進行方差分析，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對Box-Behnken 試驗結果進行分析[15]。

2 結果與分析

2.1 菌株菌落形態及顯微特征

菌株004 菌落形態與顯微特征見圖1。

由圖1 可知，菌株004 的菌落形態及顯微特征：菌落呈圓形，呈放射狀蔓延；菌絲白色，絲狀，氣生菌絲較少，有多且明顯雙核菌絲[16]。

2.2 菌株序列分析

大球蓋菇1 號菌株004 ITS 的擴增結果顯示其序列大小在800 bp 左右。將菌種ITS 序列測序后，提交至GenBank 數據庫中，進行序列分析和相似性比較，并建立系統發育樹，見圖2。

由圖2 可知菌株004 與Strophariasp.ITS 基因序列具有99%相似率，說明其屬于大球蓋菇。

2.3 菌株004 初始生物量

將大球蓋菇1 號菌株004 接種于150 mL 基礎液體培養基中培養，測得3 組菌絲球干重分別為0.882 3 g·150-1mL-1、0.892 9 g·150-1mL-1、0.901 1 g·150-1mL-1。大球蓋菇1 號菌株004 菌絲球干重平均值為0.892 1 g·150-1mL-1。

2.4 Plackett-Burman 設計試驗結果

Plackett-Burman 設計生成的12 次試驗，考察蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、玉米粉、VB1等7 個因素對大球蓋菇菌絲體干重（Y） 的影響，試驗結果如表3 所示。利用軟件Minitab 18 對試驗結果進行分析，結果如表4 所示。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及響應值Tab.3 Plackett-Burman test design and response values

表4 Plackett-Burman 試驗分析結果（已編碼單位）Tab.4 Plackett-Burman experimental results (coded units)

由表3、表4 可知，MgSO4（X5）、玉米粉（X6）和VB1(X7) 為顯著性因素，可作為進一步優化的因素。其中，X5和X7增加時，菌絲生物量增加有統計學意義（P<0.05），為正效應因素，而X6增加時，菌絲生物量降低有統計學意義（P<0.05），為負效應因素。

2.5 最陡爬坡試驗結果

為了建立更有效的響應面擬合方程，必須進行最陡爬坡試驗，最陡爬坡試驗是以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長[17]。由PB 試驗可知MgSO4、玉米粉、VB1對于大球蓋菇生物量有顯著影響，因此根據3 個因素效應的大小比例設定其變化步長進行最陡爬坡試驗，試驗設計及結果如表5 所示。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Tab.5 Design and results of steepest climbing test

表5 結果表明，在MgSO44.5 g·L-1、玉米粉4 g·L-1和VB12.6 g·L-1時，大球蓋菇1 號菌株004 的菌絲球干重最大為1.141 3 g·150-1mL-1，應將此作為最佳響應區域。

2.6 Box-Behnken 試驗設計與分析

根據表2 中的因素水平設計，利用Design-Expert 8.0.6 軟件設計3 因素3 水平Box-Behnken 試驗，結果如表6 所示。

表6 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表Tab.6 Box-Behnken central composite factor horizontal coding table

表6 結果表明，X6X7項有統計學意義；X6、X7、X5X7、X52、X62、X72項極有統計學意義，X5、X5X6無統計學意義。模型P值為0.000 2，可信度為99.99%，因此模型有意義，二次回歸方程可靠，失擬項無統計學意義（P值0.177 6>0.05），說明試驗操作可信。運用Design-Expert 8.0.6 軟件響應面分析程序對17 組試驗的響應值進行回歸分析，得到表8回歸方程方差分析表。

表7 回歸分析結果Tab.7 Regression analysis results

由表7 可知，R2=0.970 1，R2adj= 0.931 7。F值可得到X5、X6和X7對Y的影響順序：X6>X7>X5，即玉米粉>VB1>MgSO4，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行非線性的二次多項式擬合，得到的預測模型為：Y=-11.292 85+2.132 2X5+0.161 32X6+5.722 91X7-0.022 363X5X6+0.072 281X6X7-0.226 31X5X7-0.160 04X52-0.026 923X62-0.991 83X72。

2.7 響應面圖分析

將一個因素固定在0 水平，做另外2 個因素交互作用的曲面圖及等高線圖[18]，確定MgSO4、玉米粉與VB1對大球蓋菇菌絲生物量影響，如圖3~圖5。

由表7 可知，當以大球蓋菇菌絲生物量為響應值時，MgSO4與玉米粉并無交互作用。由圖3、圖4和圖5 可知，VB1與MgSO4和玉米粉的交互作用等高線圖呈明顯的橢圓形，說明交互作用顯著，對大球蓋菇菌絲生物量有顯著影響。這可能是因為VB1作為生長因子，能夠促進菌絲的生長。當VB1用量為2.5 g·L-1左右時，菌絲生物量達到最大。當VB1用量低于2.5 g·L-1時，菌絲生物量隨著VB1的增加而增加，表明在此范圍內，VB1與MgSO4和玉米粉具有協同左右，提高生長因子VB1的用量可促進菌絲的生長。當超過最佳用量時，菌絲生物量先降低后趨于穩定。這可能是因為當VB1超過一定用量時，又開始抑制菌絲的生長，因此會導致菌絲生物量的降低，但其機理尚不明確，有待進一步研究。

2.8 驗證試驗

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對最優結果進行預測，菌絲體干重（Y） 最大估值為1.193 3 g·150-1mL-1，對應的因素濃度為MgSO44.56 g·L-1、玉米粉4.25 g·L-1、VB12.43 g·L-1，即為最佳培養基配方。

為了驗證響應面分析的可靠性，采用上述最佳培養基配方做驗證性試驗，最終得到菌株004 菌絲生物量為1.215 4 g·150-1mL-1，在基礎培養條件下其菌絲生物量為0.892 1 g·150-1mL-1，優化后提高了36.2%，實測值與擬合值誤差約為1.9%，結果表明，該模型的可靠性較高，可很好地預測試驗結果，響應面法優化大球蓋菇1 號液體培養基是可行有效的。

3 討論

Plackett-Burman 設計主要用于關鍵參數的篩選，最陡爬坡試驗用于在Plackett-Burman 設計試驗結果的基礎上進一步逼近最優區域。而響應面設計是從眾多因子中尋找最佳組合的數學統計方法，能夠對影響響應值的各因子及其交互作用進行全面評價，得到最優組合[19]。

通過采用Plackett-Burman 試驗和響應面分析法考察了蔗糖、蛋白胨、玉米粉等7 個因素對大球蓋菇1 號菌絲生物量的影響，并得到相應的預測模型，優化的液體培養基組分為蔗糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、KH2PO43.00 g·L-1、MgSO44.56 g·L-1、玉米粉4.25 g·L-1、VB12.43 g·L-1，對優化后的大球蓋菇1 號液體培養基進行驗證試驗，測得最佳培養基的菌絲生物量提高36.2%，達到1.215 4 g·150-1mL-1，與模型預測結果相近，進一步驗證了模型的可靠性。而孫清波等[20]運用單因素和正交試驗優化大球蓋菇液體培養基得到的菌絲生物量為0.6 g·150-1mL-1，低于本研究優化結果，證明本研究優化結果有效，能夠為大球蓋菇液體菌種的工業化生產提供一定的理論和依據。但本試驗缺少對培養條件的優化，無法確定培養條件對菌絲生長的影響，因此在大球蓋菇液體種的培養條件上仍需進行研究。