ILT3在冠心病患者外周血單核細胞的表達及意義

劉曉峰 陳玲 廖然 殷錫虎 汪光枝

(九江市第一人民醫院 南昌大學附屬九江醫院心血管內科，江西 九江 332000)

冠心病的嚴重程度由斑塊的穩定性決定，炎癥免疫反應在斑塊穩定性中發揮重要作用〔1〕。研究表明免疫調節失衡在不穩定斑塊的發生中發揮重要作用，其中T淋巴細胞參與動脈粥樣硬化相關抗原的應答反應，促進動脈粥樣斑塊的發生和進展〔2〕。最新研究發現自身免疫在冠心病中可能發揮著重要作用〔3〕。樹突細胞(DC)是目前發現的機體內功能最強的專職抗原提呈細胞,極少量的DC即可強烈激活T淋巴細胞啟動特異性細胞免疫反應〔4〕。T淋巴細胞的激活可能在冠狀動脈粥樣硬化起始和斑塊的穩定性中起重要作用〔5〕。免疫球蛋白樣轉錄子(ILT)3，屬于抑制性受體，可表達于DC和T淋巴細胞表面，在免疫反應中發揮重要作用〔6〕。研究發現在急性冠脈綜合征(ACS)患者的破裂斑塊中和外周循環血均可檢測到異常增殖的T細胞〔7〕。本研究首先檢測冠心病患者外周血單個核細胞(PBMC)中ILT3的表達，再通過在體外建立混合淋巴細胞反應(MIR)，進一步探討ILT3參與冠心病發生發展的免疫機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2014年1月至2017年12月九江市第一人民心血管內科心內科住院冠心病患者100例，所有患者依據病史、心絞痛癥狀、心電圖、心肌酶學檢查結果分為：穩定性心絞痛(SAP)組45例，男25例，女20例，年齡(61±10)歲;ACS組55例，男43例，女12例，年齡(56±8)歲。所有患者經冠狀動脈造影檢查證實。排除標準：合并急慢性感染、膠原結締組織病、血液系統疾病、自身免疫性疾病、周圍血管病、惡性腫瘤、進展期肝腎病者；服用免疫抑制劑、非甾體類炎癥抑制劑等藥物。本研究獲得九江市第一人民醫院醫學倫理委員會批準，所有入選者簽署知情同意書。兩組年齡及性別差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1PBMC的分離 采用Ficon密度梯度離心法：所有患者在入院24 h內，在無菌條件下，空腹抽取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血10 ml用RPMI1640 1∶1培養稀釋到20 ml，用毛細滴管插到云霧層，全部吸取單個核細胞(避免吸出分層液)，置入另一離心管中，然后加入5倍以上體積的RPMI1640液，1 500 r/min×10 min，洗滌細胞兩次，獲得PBMC。

1.2.2外周血DC分離和體外培養 在無菌條件下，用37℃無血清的RPMI1640液體培養基充分吹打上述分離得到的PBMC，使成均勻細胞懸液，用濃度為50 ng/ml的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和50 ng/ml的重組人白細胞介素(rhIL)-4,37℃、5%CO2條件下培養5 d。第6天加入白細胞介素(IL)-1β(10 ng/ml),腫瘤壞死因子(TNF)-α(50 ng/ml)和Toll樣受體配體polyⅠ:C(20 μg/ml),均購自美國Sigma公司。繼續培養2 d,第8天收獲懸浮細胞，顯微鏡下鑒定。

1.2.3應用MACS 免疫磁珠陰性分選得CD4+T淋巴細胞 采用Ficon密度梯度離心法分離臍帶血獲得的PBMC，用RPMI1640 1∶1培養稀釋到10 ml，采用應用MACS 免疫磁珠陰性分選，將分選獲得的CD4+T淋巴細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液中，調整細胞濃度在1×106/ml，備用。提取的CD4+T調節性T細胞以流式細胞儀行純度檢測。

1.2.4細胞因子檢測 各組分離培養的DC和臍血分離的CD4+T細胞混合培養。4 d后,收集細胞培養上清,利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測干擾素(IFN)-γ、TNF-β和IL-10細胞因子水平,在酶標儀上,于450 nm波長處檢測光密度(D)值。用流式細胞儀檢測CD4+CD25+T淋巴細胞的百分比，實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測樣品 上述分離純化的細胞用10%FBS RPMI1640調整細胞濃度為1×106/ml,取細胞懸液100 μl，分別加入6 μl CD4-PE、6 μl ILT3-FITC抗體，混合反應后，操作同前，上流式細胞儀檢測;然后獲取條件分別為CD4-PE、CDILT3-FITC陽性。依次收集標本，收集細胞數至少5 000個細胞，分析熒光強度，數據存盤，測試結束后在計算機上用CellQustPlot軟件進行數據分析，計算獲得細胞百分數表示。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1ILT3在兩組PBMC的表達 SAP組PBMC的ILT3 陽性率為〔(80.13±2.10)%〕，顯著高于ACS組〔(1.83±0.91)%，P<0.01〕。

2.2兩組CD4+CD25+T淋巴細胞百分比比較 SAP組CD4+CD25+T淋巴細胞數量百分比為〔(89.2±2.3)%〕，較ACS組〔(39.5±5.3)%〕明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3兩組細胞因子水平比較 ACS組IFN-γ和TNF-β水平比SAP組明顯升高，IL-10水平在SAP組比ACS組有明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 兩組細胞因子水平比較

與SAP組比較：1)P<0.01

3 討 論

研究表明，炎癥免疫反應參與動脈粥樣硬化的發生、發展以致易損斑塊和血栓的形成〔8〕。其中T細胞參與的免疫激活在冠脈斑塊破裂中起主導作用〔9〕。急性冠狀動脈綜合征(ACS)的發生中，冠狀動脈易損斑塊的形成可能是T細胞介導的一種免疫失衡性疾病〔10〕。研究表明,在機體免疫耐受的產生和維持中起重要作用的CD4+CD25+T調節細胞，通過負向調節來抑制自身反應性T細胞的作用,發揮免疫耐受，減少炎癥免疫性疾病的發生〔11〕。盡管目前尚未將動脈粥樣硬化歸類于自身免疫性疾病。但有動物實驗研究顯示CD4+CD25+T調節細胞能夠增加斑塊的穩定性〔12〕。研究已經表明CD4+CD28-T淋巴細胞能夠直接溶解內皮細胞及平滑肌細胞，而導致斑塊破裂〔13〕，與CD4+CD28-T細胞亞群作用相反,CD4+CD25+T是最近研究發現的調節性T細胞亞群之一，參與調節與冠狀動脈斑塊的穩定性〔2〕。ILT3可表達于DC表面，傳導抑制性信號，抑制殺傷性NK 細胞的活性，參與細胞抗原俘獲、抑制細胞炎癥免疫作用〔14〕。 有研究表明，高表達ILT3的DC細胞可抑制T淋巴細胞的增殖與活化〔15〕。ILT3可通過抑制DC的共刺激分子的表達，同時誘導CD4+T細胞轉化為CD4+CD25+T的調節性T細胞〔16〕。本研究結果顯示PBMC中ILT3表達的變化參與冠心病的發生發展中。

將抗原特異性CD4+CD25+T淋巴細胞輸入小鼠觀察到其可抑制動脈粥樣硬化的發展,說明CD4+CD25+T淋巴具有負向調節動脈粥樣硬化炎癥反應的作用〔17〕。急性心肌梗死患者CD4+CD25+T淋巴細胞表達百分比與正常對照組相比會降低，這表明可能在冠狀動脈粥樣斑塊活動或破裂過程中發揮重要作用〔18〕。本研究推斷CD4+CD25+T淋巴細胞對維持動脈粥樣硬化患者斑塊的穩定性發揮重要作用且與ILT3高表達相關。

抗原提呈細胞是啟動免疫應答的起始環節，DC是目前發現的機體內功能最強的專職抗原提呈細胞，最近發現在冠狀動脈粥樣硬化斑塊中DC增多〔19〕。成熟的DC可分泌多種細胞因子，參與T淋巴細胞的增殖和免疫調節功能〔20〕。本研究提示高表達ILT3的DC釋放IL-10而穩定斑塊。