miR-1301對胃癌細胞侵襲的影響及分子機制

杜銳玲 楊茂農

(四川省人民醫院中醫科，四川 成都 610072)

胃癌(GC)，是常見的上消化道惡性腫瘤之一，尤其在幽門螺桿菌感染者中更為高發〔1〕。GC的病理類型以腺癌為主，臨床上GC癥狀隱匿，已發生淋巴結及肝臟轉移，故患者術后長期生存率較低〔2〕。

微小核糖核苷酸(miR)是一種單鏈短RNA〔3〕。miR-1301的異常表達與癌癥的發生發展密切相關。例如，miR-1301在甲狀腺癌中表達下調并且與腫瘤體積和淋巴結轉移等惡性臨床特征密切相關〔4〕。預后分析發現，低表達miR-1301的卵巢癌患者預后不良，且miR-1301的低表達是患者不良預后的獨立危險因素之一〔5〕。但是，miR-1301在GC中的表達、臨床意義及生物學功能尚不完全清楚。本研究旨在探索miR-1301對GC侵襲的影響，以期對miR-1301成為GC分子治療靶標提供理論依據。

1 材料和方法

1.1組織標本 四川省人民醫院2013年1月至2015年12月收治的60例GC組織與對應癌旁組織，男40例，女20例。

1.2細胞來源及主要試劑 GES-1、MGC-803、SGC-790、MKN45、AGS細胞由四川省人民醫院中醫科實驗室保存；miR-1301(miR10005797-1-5)及陰性對照(miR01201-1-5)mimics購自廣州銳博生物技術公司；miR-1301(miRQ0005797-1-1)及U6(MQP-0201)引物購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑(15596026)、RT-PCR試劑盒(SuperScript?One-Step RT-PCR System with Platinum?Taq DNA Polymerase,10928042)、qPCR試劑盒(DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit，F415L)及轉染試劑Lipofectamine 2000(11668-027)均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國康寧公司，兔抗人STAT3多克隆抗體(12640)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體(40994)及鼠抗人β-actin單克隆抗體(3700)均購自美國CST公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；DMEM液體細胞培養基購自Mediatech公司；基質膠購自美國BD公司。

1.3qRT-PCR 標本及細胞RNA由Trizol試劑提取。反轉錄PCR條件設定為：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循環次數1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循環40次；72℃ 10 min。通過2-△△Ct法檢測組織及體外培養細胞中miR-1301的相對含量。

1.4細胞培養及mimics轉染 MGC-803細胞于適宜條件下培養至穩定傳代。將MGC-803細胞按適宜密度接種6孔板。實驗分組：miR-1301組(miR-1301)每孔加入100 pmol的miR-1301 mimics、2 ml完全培養基及5 μl Lipofectamine 2000；陰性對照(miR-control)組每孔加入100 pmol的miR-control mimics、2 ml完全培養基及5 μl Lipofectamine 2000。轉染24 h后進行下一步實驗。

1.5Transwell小室 按1∶8比例采用無血清DMEM培養液稀釋基質膠后，按每孔100 μl包被Transwell小室膜的上室面，制作侵襲小室模型；無基質膠包被的Transwell小室用于細胞遷移實驗。取對數生長期的MGC-803細胞以無血清培養基按每孔2萬個接種于上室，下室內加入750 μl含10%血清的完全培養基。培養24 h后移除培養基，甲醛固定細胞，結晶紫染色。倒置白光顯微鏡下觀察細胞侵襲，計數遷移或者侵襲細胞數目。

1.6Western印跡 RIPA試劑提取細胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉膜150 min，5% 牛血清白蛋白封閉1 h后將條帶孵育于1∶1 000比例稀釋的相應一抗中。4℃過夜后，使用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗孵育條帶1 h。電化學發光(ECL)法曝光條帶。

1.7統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗，t檢驗，Kaplan-Meier生存曲線。

2 結 果

2.1miR-1301在GC組織中低表達 通過熒光實時定量PCR檢測發現,60例GC組織中miR-1301的表達水平(0.581±0.043)明顯低于癌旁組織(1.338±0.056，t=2.419，P=0.026)。

2.2miR-1301表達與GC臨床病理特征及患者預后的關系 以GC組織中miR-1301在GC組織中平均表達水平為界值，將60例GC組織分為miR-1301高表達組(n=22)及低表達組(n=38)。統計結果表明，淋巴結轉移較多出現在miR-1301低表達的GC患者中(P<0.05)，提示miR-1301可能與腫瘤侵襲轉移相關。見表1。

表1 miR-1301表達的臨床病理意義分析(n)

Hp：幽門螺桿菌

通過術后隨訪，獲得了上述兩組3年的生存資料，使用Kaplan-Meier生存曲線法分析后發現，miR-1301低表達組3年總體生存率(HR=2.140，P=0.021)及無病生存率(HR=3.437，P=0.015)較miR-1301高表達組更低。見圖1。多因素分析發現，淋巴結轉移、miR-1301低表達是GC患者預后不良的獨立危險因素之一(P<0.05)，見表2。

圖1 miR-1301異常表達對患者預后的影響

表2 GC患者術后3年生存率相關因素的COX比例風險回歸分析(n=60)

2.3miR-1301對GC細胞遷移及侵襲的影響 為研究miR-1301在GC中的生物學功能，本研究利用基因轉染技術構建了miR-1301過表達細胞模型。轉染miR-1301 mimics的細胞內miR-1301表達水平較miR-control組明顯升高〔miR-control組為1.03±0.28、miR-1301組為9.46±1.38，t=10.285，P=0.009)。通過Transwell遷移小室模型的檢測得知，miR-1301組遷移細胞數量為(21.11±3.25)個，miR-control組遷移細胞數量為(42.38±5.01)個，差異具有統計學意義(t=6.423，P=0.021)個。同樣，miR-1301組侵襲細胞數量為(10.29±2.04)個，miR-control組侵襲細胞數量為(23.46±3.18)個，差異具有統計學意義(t=3.128，P=0.030)。見圖2。

圖2 miR-1301對MGC-803細胞遷移、侵襲的影響(×100)

2.4過表達miR-1301對下游靶點STAT3的調控作用 過表達miR-1301抑制STAT3蛋白和MMP-2 mRNA表達水平。見圖3。

圖3 過表達miR-1301對MGC-803細胞內STAT3及MMP-2表達的影響

為驗證STAT3是否為miR-1301的潛在作用靶點，本研究通過Western印跡檢測了過表達miR-1301后MGC-803細胞內STAT3表達的變化。結果表明，miR-1301組MGC-803細胞內STAT3蛋白表達水平為(0.13±0.05)，miR-control組STAT3蛋白表達水平為(0.51±0.10)，差異有統計學意義(t=3.781，P=0.028)。通過Western印跡檢測了MMP-2的表達，結果發現，miR-1301組細胞MMP-2蛋白表達水平為(0.23±0.04)，miR-control組MMP-2蛋白表達水平為(0.42±0.09)，差異有統計學意義(t=2.168，P=0.036)。

3 討 論

MMP-2是STAT3調節腫瘤侵襲能力的效應基因之一〔6〕。miR-1301作為一種新發現的microRNA，其在不同類型的惡性腫瘤中的生物學功能并不完全相同。在前列腺癌中，miR-1301高表達并促進腫瘤細胞干性〔7〕；而在乳腺癌中，miR-1301卻抑制了腫瘤細胞的增殖〔8〕。本研究我們通過PCR檢測得知，GC組織中miR-1301的表達水平呈明顯降低趨勢。臨床數據分析結果顯示，低表達miR-1301的患者多存在淋巴結轉移，且這部分患者預后較差。這表明miR-1301在GC中的缺失導致了腫瘤發生轉移，造成患者早期復發和死亡。為驗證這一假設，本研究結果證實，miR-1301具有削弱腫瘤細胞遷移及侵襲的效果。另外，最新文獻也指出，miR-1301也能夠抑制腫瘤細胞的增殖并促進細胞凋亡〔9〕。說明miR-1301的抗腫瘤效應具有生物多樣性，值得我們在今后的工作中進一步深入研究。

MicroRNA能夠通過結合靶基因(3′-UTR)區而發揮負向調控作用〔10〕。通過生物信息學檢索分析我們發現，STAT3可能是miR-1301的下游靶點之一。既往研究〔11〕也表明STAT3在胃癌內高表達且具有促癌作用。通過蛋白印跡試驗我們發現，過表達miR-1301在體外的確能下調STAT3的表達水平。MMP對腫瘤侵襲轉移均具有促進作用〔12〕。STAT3是一種重要的癌性轉錄因子，研究指出，MMP-2的轉錄受到STAT3的調節〔13〕。本研究提示miR-1301的抑制腫瘤遷移及侵襲作用可能是通過抑制STAT3/MMP-2信號通路的活化來實現的。

關于miR在腫瘤中異常表達的機制，目前認為主要與兩方面因素有關：一是，長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為分子海綿結合microRNA，導致microRNA的表達下降，并失去生物活性。第二種潛在的機制是miR表達的表觀遺傳學調控。對于miR-1301，有研究顯示，LINC01433能夠促進肝細胞癌的進展，其機制正是通過結合并下調miR-1301的表達而實現的〔14〕。在甲狀腺癌中的研究結果還指出，由STAT3上調的LncRNA ABHD11-AS1能夠通過與miR-1301相結合而抑制其生物學功能〔15〕，這一結果提示STAT3-miR-1301在腫瘤中可能存在一個負反饋關系，但仍需在今后的研究中進一步證實。

綜上，miR-1301在GC中低表達，miR-1301抑制GC侵襲的作用可能是通過調控STAT3/MMP-2信號通路的活化來實現的。