CXC趨化因子配體8對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖與遷移的影響及作用機(jī)制

符婕 王紅 孫紅梅

(1佳木斯市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 佳木斯 154002;2佳木斯市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

宮頸癌(UCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，位居女性所有惡性腫瘤的第四位。在全部惡性腫瘤中UCC也高居前列，是全球第七大惡性腫瘤〔1〕。其發(fā)病率存在顯著的地區(qū)差異，有超過(guò)85%的UCC患者來(lái)自于發(fā)展中國(guó)家，占女性惡性腫瘤的13%。此外，UCC相關(guān)死亡率為52%，也多見于發(fā)展中國(guó)家〔2〕。UCC的危險(xiǎn)因素包括慢性炎癥、吸煙、應(yīng)用口服避孕藥、維生素A和E 攝入不足等〔3〕。趨化因子是一類小分子蛋白質(zhì)，它們可以調(diào)控多種組織的功能，包括內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和在炎癥條件下細(xì)胞的招募和激活。CXC趨化因子配體(L)8是CXC趨化因子中谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)+亞家族中的一員，它可經(jīng)其受體CXCR1和CXCR2調(diào)控細(xì)胞的多種功能。大量研究表明，在適當(dāng)?shù)拇碳は拢珻XCL8可以被多種細(xì)胞所分泌，如單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞等〔4〕。近年來(lái)諸多研究表明，CXCL8在多種腫瘤中發(fā)生表達(dá)上調(diào)，并且其可通過(guò)多種信號(hào)途徑，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子(NF)-κB而參與并影響腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成等〔5〕。本實(shí)驗(yàn)研究外源性及過(guò)表CXCL8是否可經(jīng)內(nèi)分泌和自分泌機(jī)制影響HeLa細(xì)胞增殖和遷移的惡性行為，同時(shí)探尋CXCL8發(fā)揮作用的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1主要細(xì)胞、試劑和材料 HeLa宮頸癌細(xì)胞(美國(guó)典藏細(xì)胞庫(kù))；RPMI1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美國(guó)GIBCO公司)；CXCL8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢博士德公司)；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑(CCK)-8試劑盒(碧云天生物)；細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶及細(xì)胞遷移(Transwell)小室(美國(guó)Hyclone公司)；AKT抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HeLa細(xì)胞按5×105個(gè)/孔培養(yǎng)在6孔板中，孔板中的培養(yǎng)基為3 ml含15% FBS、無(wú)青鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基；細(xì)胞在95%飽和濕度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h；移除培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 2000試劑操作手冊(cè)對(duì)細(xì)胞實(shí)施轉(zhuǎn)染；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，然后用4 ng/μl的遺傳霉素(G418)進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選；應(yīng)用ELISA來(lái)鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.3ELISA 將細(xì)胞按6×105個(gè)/孔培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)基為1 ml含2 % FBS的RPMI1640；待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并在室溫下離心以去除細(xì)胞碎片；按照CXCL8 ELISA試劑盒操作檢測(cè)上清液中CXCL8含量。

1.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 為了明確外源性CXCL8是否調(diào)控了HeLa細(xì)胞增殖，將HeLa細(xì)胞按2.0×103細(xì)胞/孔接種到96孔板中，細(xì)胞所用培養(yǎng)基為100 μl含不同濃度重組CXCL8(0、20、40或60 ng/ml)的RPMI1640；在CXCL8自分泌研究中，將親代、空載體轉(zhuǎn)染和CXCL8轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞(1.5×103細(xì)胞/孔)培養(yǎng)在96孔板中。將上述實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在95%飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h；按照CCK-8操作后，在酶標(biāo)儀下讀得450 nm處的光密度值，以確定細(xì)胞增殖情況。

1.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 利用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行下列步驟研究外源性及過(guò)表達(dá)CXCL8對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響。①外源性研究：將2×104個(gè)HeLa細(xì)胞重懸于100 μl無(wú)FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)于Transwell上室中，將600 μl含10 %FBS和不同濃度重組CXCL8(0、20、40或60 ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基置于Transwell下室中；②過(guò)表達(dá)研究：將2×104個(gè)親代、空載體轉(zhuǎn)染和CXCL8轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞分別重懸于100 μl無(wú)FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)于Transwell上室中，將600 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基置于Transwell下室中。將上述實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在95%飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和36 h；然后用棉簽刮去小室上表面的非遷移細(xì)胞；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，在室溫下用含0.5%結(jié)晶紫溶液的95%乙醇固定染色20 min；PBS清洗后，在顯微鏡下隨機(jī)觀察和計(jì)數(shù)5個(gè)視野的遷移細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的篩選 親代、空載體轉(zhuǎn)染和過(guò)表達(dá)CXCL8的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CXCL8分泌性蛋白的表達(dá)量分別為(205.44±12.91)、(199.86±17.18)和(403.16±17.03)ng/ml。HeLa細(xì)胞可表達(dá)CXCL8分泌性蛋白。與親代和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株比較，過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的CXCL8分泌性蛋白水平顯著升高(P<0.01)，提示成功構(gòu)建了CXCL8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

2.2外源性CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖 與0 ng/ml CXCL8比較，不同濃度外源性CXCL8可顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖活性(P<0.05)。見表1。

2.3過(guò)表達(dá)CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖 培養(yǎng)48 h和72 h后，過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖率顯著高于親代和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(P<0.05)。見表2。

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間外源性CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖光密度)

與0 ng/ml比較：1)P<0.05；2)P<0.01；表3同

表2 培養(yǎng)不同時(shí)間過(guò)表達(dá)CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖光密度)

與親代、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較：1)P<0.05；2)P<0.01

2.4外源性CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移 不同濃度的外源性CXCL8可顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移活性(P<0.05)。見表3。

表3 誘導(dǎo)遷移不同時(shí)間外源性CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞遷移個(gè))

2.5過(guò)表達(dá)CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移 過(guò)表達(dá)細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)顯著高于親代和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(P<0.01)。見表4。

表4 誘導(dǎo)遷移不同時(shí)間過(guò)表達(dá)CXCL8促進(jìn)HeLa細(xì)胞遷移個(gè))

與親代、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較：1)P<0.01

2.6過(guò)表達(dá)CXCL8上調(diào)AKT蛋白的表達(dá) 親代、空載體轉(zhuǎn)染及CXCL8過(guò)表達(dá)細(xì)胞AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是0.468±0.10、0.493±0.08和0.980±0.13。與親代和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株比較，CXCL8過(guò)表達(dá)細(xì)胞的AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高(P<0.01)。

3 討 論

作為促炎性ELR+CXC類趨化因子，CXCL8最初被命名為中性粒細(xì)胞趨化因子，這是由于其可通過(guò)影響嗜中性粒細(xì)胞的趨化與激活，在天然免疫的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔6〕。因此，CXCL8與許多炎癥性疾病如炎癥性腸病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等密切相關(guān)〔5〕。盡管炎癥是機(jī)體對(duì)組織損傷的一種生理性保護(hù)過(guò)程，但近年的研究顯示，它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及演進(jìn)中也扮演重要角色。據(jù)統(tǒng)計(jì)，許多慢性炎癥狀態(tài)會(huì)顯著增加患某種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，近20%的癌癥是由慢性炎癥或炎癥狀態(tài)引發(fā)的〔7〕。局部組織的慢性炎癥可使細(xì)胞基因組出現(xiàn)不穩(wěn)定而發(fā)生惡變，并進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成。在女性生殖系統(tǒng)中，人類乳頭瘤狀病毒(HPV)感染被認(rèn)為是宮頸癌進(jìn)展的主要危險(xiǎn)事件，提示炎癥在UCC發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要的作用。

近年來(lái)，大量研究表明，CXCL8在多種腫瘤組織中被檢測(cè)到表達(dá)上調(diào)。例如，在前列腺癌中，腫瘤患者血清 CXCL8水平較健康志愿者顯著提高，并且其表達(dá)水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移和分期具有顯著相關(guān)性〔8〕。又如，CXCL8在膀胱癌中也出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，它的過(guò)度表達(dá)與疾病晚期有關(guān)，且高表達(dá)CXCL8可顯著降低膀胱癌患者的總體生存率〔9〕。另外，大量研究亦揭示了CXCL8參與多種腫瘤的發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程。如在前列腺癌中，雄激素依賴是腫瘤發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)力，Seaton等〔10〕應(yīng)用體外模型實(shí)驗(yàn)研究了CXCL8信號(hào)在驅(qū)動(dòng)雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，CXCL8可通過(guò)雄激素非依賴方式誘導(dǎo)雄激素受體的表達(dá)和活化，并促進(jìn)雄激素依賴前列腺癌細(xì)胞 LNCaP和22RV1的增殖。目前人們普遍認(rèn)為，招募到腫瘤部位的中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤進(jìn)程至關(guān)重要，特別是腫瘤血管的生成。既然CXCL8的主要生理功能是趨化和激活中性粒細(xì)胞，表明CXCL8可參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤促進(jìn)作用。已有研究表明，通過(guò)抑制 CXCL8或其受體 CXCR1/2可延緩中性粒細(xì)胞向腫瘤部位的招募和趨化，并最終抑制腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)外源性和過(guò)表達(dá)CXCL8可顯著促進(jìn)HeLa UCC細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時(shí)機(jī)制研究顯示，HeLa細(xì)胞過(guò)表達(dá)CXCL8可顯著上調(diào)AKT蛋白的表達(dá)。這說(shuō)明CXCL8可經(jīng)PI3K/AKT信號(hào)途徑參與UCC的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程，該研究將補(bǔ)充人們對(duì)UCC發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并可為其臨床診治提供一定的借鑒思路。