通關藤對肝癌細胞的調節作用及相關機制

彭鵬 程然 趙逸超 祝朝前

(唐山市工人醫院肝膽外一科，河北 唐山 063000)

肝細胞性肝癌(HCC)是目前最為常見的惡性腫瘤，是全球范圍內第三大癌癥相關性致死性疾病〔1〕。早期HCC的治療一般采取外科手術切除、射頻消融、動脈化療栓塞以及常規方案化療。然而由于HCC早期階段的無癥狀性，HCC患者表現出臨床癥狀往往錯過了最佳的治療階段。目前，對于HCC多采用綜合治療方案，其中抗腫瘤藥物的應用仍然是延緩HCC疾病發展，提高患者生存質量的常規方案。但是，對于中晚期HCC患者的治療仍表現為轉移風險高、預后效果差的特點，5年生存率不足5%〔2〕，因此臨床上亟待開發HCC新型治療型藥物。研究顯示，通關藤(GFR)作為天然活性藥物，具有廣泛的藥理學活性，主要表現為抗腫瘤、平喘、降壓、免疫抑制及保肝利尿作用〔3〕。但對于其抗腫瘤作用機制的研究尚不明確，特別是對于HCC的抗腫瘤活性仍需要深入研究和探討。本試驗主要研究通關藤對于人肝癌細胞HepG2增殖和侵襲的影響，并進一步討論其對于血管內皮生長因子(VEGF)-D相關腫瘤細胞增殖和侵襲的潛在調節作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株HepG2(唐山市工人醫院科研中心提供)；GFR制劑(20 ml/支，批號：201806121，南京圣和藥業，商品名：消癌平，每1 ml相當于1 g原藥材)；細胞培養液DMEM(GIBCO公司,美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；RIPA蛋白裂解液(江蘇碧云天公司)；MTT(Sigma公司)；抗體VEGF-D(Santa Cruz公司)；抗體β-Actin(Cell Signal公司)。

1.2試驗方法

1.2.1人肝癌細胞株HepG2培養 取人肝癌細胞株HepG2在含有10%DMEM培養基中(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，37℃、5%CO2飽和濕度體外培養，每24 h半量更換培養基，應用0.25%胰酶消化傳代培養，用于試驗干預處理。

1.2.2通關藤制劑藥物處理HepG2細胞 取人肝癌細胞株HepG2在含有10%DMEM培養基中，37℃、5%CO2飽和濕度體外培養，24 h半量換液后，接種于96孔板或6孔板，隨機分為溶劑對照組、藥物干預組(10 mg/ml組、20 mg/ml組、40 mg/ml組)。

1.2.3噻唑藍(MTT)法檢測HepG2細胞增殖率 取正常培養人肝癌細胞株HepG2細胞接種于96孔板，各組分別給予不同處理，溶劑對照組給于等體積培養基，藥物干預組分別給于GFR終濃度10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml處理，培養24 h后，每孔加入20 μl MTT液(3.6 mmol/L)，37℃孵育4 h，棄上清，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩溶解甲臜結晶，酶標儀測定570 nm波長處的吸光度值，每組設定5個復孔，以對照組吸收度的均值為100%，細胞的存活率=(各樣本吸收度值-空白組吸光度值)/(對照組吸收度-空白組吸光度值)×100%。

1.2.4劃痕法檢測HepG2細胞侵襲率 取試驗細胞制備HepG2單細胞懸液，每孔1×106接種于6孔板，37℃、5%CO2條件全營養培養，待貼壁完全，設置溶劑對照組，藥物干預組(20 mg/ml)。利用tip槍頭用力均勻在培養皿中劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。37℃、5%CO2條件繼續培養，每24 h測量一次細胞遷移距離，進而評價GFR針對肝癌細胞株HepG2細胞侵襲的影響。侵襲率=(劃痕面積0 h-劃痕面積24 h)/劃痕面積0 h。

1.2.5Western印跡法檢測VEGF-D表達水平 取正常培養人肝癌細胞株HepG2細胞接種于6孔板，設置溶劑對照組，藥物干預組(20 mg/ml)。RIPA裂解細胞，離心取上清，提取總蛋白。提取蛋白10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)分離蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)4℃轉膜2 h，5% TTBS(Tris-HCl緩沖液，0.1% Tween-20)室溫封閉2 h，VEGF-D抗體4℃孵育過夜，TBS-T(10 mmol/L Tris-HCl緩沖液,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20)，二抗室溫孵育2 h，電化學發光(ECL)法處理，Image J圖像分析軟件對條帶進行定量分析。

1.3統計學分析 采用SPSS15.0進行t檢驗。

2 結 果

2.1GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞增殖的影響 相比溶劑對照組〔(100±0.00)%〕，10、20、40 mg/ml GFR干預HepG2細胞24 h，細胞活力分別為(97.2±3.2)%、(87.3±4.7)%、(84.8±7.4)%，隨著藥物濃度的增大，OD值均逐漸減少，抑制HepG2細胞增殖率顯著增大。20 mg/ml組干預24 h開始抑制溶劑HepG2細胞增殖，相比溶劑對照組，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。這說明GFR對于HepG2細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴關系。

2.2GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞侵襲的影響 相比溶劑對照組〔(88.7±2.8)%〕，GFR 20 mg/ml組〔(54.5±2.4)%〕能夠顯著性抑制HepG2細胞侵襲。見圖1。

2.3Western印跡法檢測VEGF-D在人肝癌細胞株HepG2細胞的表達 給予GFR干預處理24 h后，相比溶劑對照組細胞，VEGF-D表達顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 GFR對人肝癌細胞株HepG2細胞VEGF-D表達的影響

與溶劑對照組比較：1)P<0.05

1～4：溶劑對照12 h，GFR 12 h，溶劑對照24 h，GFR 24 h圖2 GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞VEGF-D表達的影響

3 討 論

腫瘤增殖和侵襲是一個多因素的發展過程，涉及原發病灶的形成，細胞脫落，血管生成等多個環節。其中抑制腫瘤血管的生成已經成為近年來抗腫瘤研究的熱點領域，特別是針對HCC腫瘤發展起重要調控作用。相關研究報道，VEGF-D參與并促進了轉移灶的形成〔4〕。有研究顯示，VEGF-D在肝內皮細胞增殖和侵襲方面起重要調節作用，還與淋巴管的新生和發展聯系緊密〔5〕。研究顯示，VEGF-D是激活腫瘤血管生成的重要信號通路，還是轉移灶形成過程中的重要步驟及腫瘤轉移后發展的重要調節因子〔6,7〕。因此探索調控VEGF-D的有效途徑對于開發HCC治療型藥物意義重大。

GFR為蘿藦科牛奶菜屬植物，主要分布在中國貴州、云南、福建等地，在當地民間癌癥治療上有不錯效果。研究發現，通關藤具有免疫調節、保肝利尿、敗毒抗癌等功效〔3〕。有文獻報道，GFR對于胃癌〔8〕、食管癌〔9〕、腸癌〔10〕等表現出明顯的抑制增殖作用，但是尚未闡明GFR的抗腫瘤機制。本研究主要是討論GFR對于人肝癌HepG2細胞功能的影響，主要從細胞增殖和侵襲兩個方面開展研究，并深入討論其調控機制。本試驗研究結果顯示，GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞增殖具有顯著的抑制作用。表明GFR作為天然抗腫瘤活性藥物，對于人肝癌細胞株HepG2細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴關系。GFR處理24 h能夠明顯抑制HepG2細胞侵襲。表明，通關藤在調控HepG2細胞增殖和侵襲方面均表現出明顯的抑制作用。GFR顯著性的抑制HepG2細胞VEGF-D的表達，隨著干預時間延長，VEGF-D的表達逐漸降低，當給藥時間到達24 h，VEGF-D的表達水平相比對照組出現顯著性降低。

綜上所述，VEGF-D參與腫瘤血管生成和轉移灶的形成，HCC腫瘤細胞HepG2過表達VEGF-D，這種由VEGF-D所介導的HepG2細胞增殖和侵襲能夠被GFR所逆轉。結合本研究試驗結果，GFR抑制HepG2細胞增殖和侵襲的同時伴隨著VEGF-D表達的顯著降低。本試驗結果為HCC抗腫瘤治療提供潛在的治療可能，特別是針對高轉移風險高、不良預后效果的HCC腫瘤的治療提供重要理論依據。