環境DNA在水體中存留時間的檢測研究——以中國對蝦為例*

李 苗 單秀娟 王偉繼 丁小松 戴芳群 呂 丁 吳歡歡

環境DNA在水體中存留時間的檢測研究——以中國對蝦為例*

李 苗1,3單秀娟1,2①王偉繼1,2丁小松1,3戴芳群1,2呂 丁1吳歡歡1

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 山東省漁業資源與生態環境重點實驗室 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3. 上海海洋大學海洋科學學院 上海 201306)

精確地掌握物種的分布與種群動態是保護生物學的基礎。然而，對于某些具有特殊生活史的物種以及群體數量非常少的種群而言，物種分布檢測極其困難。DNA條形碼技術與環境DNA(Environmental DNA, eDNA)的結合使以上困難得以解決。鑒于eDNA易降解、在環境中含量低的特性，探究其在環境中的持續存留時間對于后續準確進行定性與定量分析至關重要。本研究以中國對蝦()為研究對象，結合實時熒光定量PCR定量分析了水環境中eDNA隨時間的降解情況，基于赤池信息準則(Akaike Information Criterion, AIC)，選擇了最適于eDNA隨時間降解的統計模型。結果顯示，當eDNA的釋放源頭被去除后，eDNA在水體中的含量與時間呈負相關關系，其在環境中的存留時間為30 d左右。本研究旨在為合理規劃物種的定性檢測與定量評估提供理論依據，以期將人為因素造成的實驗誤差降到最低。

環境DNA；存留時間；中國對蝦

全球漁業衰退是21世紀面臨的重大挑戰之一(Dudgeon, 2010; 金顯仕等, 2015; Evans, 2018)。然而，對研究人員與政策制定者而言，收集水生生物種群分布與種群動態變化的精確數據是其面臨的最大挑戰(Thomsen, 2015)，特別是對于某些密度極小與具有特殊生活史的種群，檢測其時空分布與調查其種群動態變化將變得更加困難(Mackenzie, 2005; Dejean, 2011)。為了克服以上困難，DNA條形碼技術被成功地應用到水生生態系統中，檢測來自生物體細胞外的DNA(即eDNA)(Bohmann, 2014; 單秀娟等, 2018)，進而通過eDNA去掌握物種的分布與種群動態變化。該方法不需要采集生物樣本，對生態系統無傷害且經濟高效。目前，該方法已成功應用到生物檢測(Goldberg, 2015; Davison, 2017)、生物多樣性評價(Drummond, 2015; Majaneva, 2018)、生物量評估(Pillioddavid, 2013; Tillotson, 2018)、魚類洄游(Yamanaka, 2016)以及其他方面(Sigsgaard, 2016、2017)的研究中。

由于eDNA極易降解，且在環境中含量極低，因而，其在環境中的存留時間將會直接影響后期的定性與定量分析。為了能夠將eDNA技術準確地應用到水生生態系統的研究領域中，探究eDNA在水體中的存留時間顯得尤為重要。eDNA在環境中的存留時間是指切斷eDNA的來源之后，eDNA在環境中的持續存在時間(Dejean, 2011)。雖然，已有相關研究表明，eDNA在水體中呈指數式降解(Dejean, 2011; Strickler, 2015)，但不同的物種具有不同的生活史，其釋放eDNA的速率各不相同(Minamoto, 2017)，從而導致不同物種釋放的eDNA在水體中的存留時間不同。本研究以中國對蝦()為研究對象，結合實時熒光定量PCR，檢測eDNA在水體中的存留時間，同時，探究eDNA降解速率與時間之間的關系。本研究旨在為水生生態系統eDNA的取樣、操作流程優化、整體實驗方案設計及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 特異性引物設計

針對中國對蝦的線粒體細胞色素酶氧化亞基Ⅰ(COⅠ)基因設計特異性引物。在GenBank數據庫中檢索中國對蝦線粒體DNA (mtDNA) COⅠ基因序列(GenBank登錄號: gbHQ700930.1)，利用BioEdit和MEGA7軟件進行序列比對，使用Primer Premier 6與Beacon Designer 8軟件設計引物與探針，并在NCBI網站上進行引物特異性測試。

篩選確定1對特異性擴增中國對蝦COⅠ基因的目的片段為597 bp的普通PCR引物(COⅠPF：TTGT AGTTACAGCCCACGCT，COⅠPR：AAATTATCCC?GAAGGCGGGT)與1對目的片段為106 bp的熒光定量PCR引物(COⅠDF：AGGGGTAGGAACAGGATG?AAC，COⅠDR：GACACCAGCTAGATGCAGCG，Probe：5￠FAM-TCAGCTAGAATTGCTCATGCCGGA?GCTTCAGT-3￠BHQ1)，其中，普通PCR引物用來制備質粒標準品DNA，定量PCR引物所擴增的目的片段為普通PCR引物所擴增目的片段的一部分。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 中國對蝦肌肉組織DNA提取及PCR擴增

實驗所用中國對蝦肌肉組織取自2016年渤海漁業資源調查捕獲的中國對蝦，–20℃保存。

中國對蝦肌肉組織DNA的提取采取傳統的酚–氯仿–異戊醇方法，提取完成后，使用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋到50 ng/μl，用1.5 ml無菌離心管分裝，–20℃保存。25 μl PCR反應體系：10×Buffer 2.5 μl，dNTPs (各2.5 mmol/L) 0.5 μl，正反向引物(COⅠPF/COⅠPR)(10 mmol/L)各0.5 μl，DNA Polymerase(5 U/μl) 0.5 μl，模板DNA (50 ng/μl) 1 μl, MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，ddH2O 18 μl。PCR擴增反應條件：94℃預變性3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃ 1 min，擴增35個循環；72℃復延伸10 min。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 中國對蝦mtDNA COⅠ基因克隆及質粒標準品制備

將1.2中PCR產物用Gel Extraction Kit (OMEGA)試劑盒進行純化。將純化的PCR產物連接到pMD-18-T質粒載體(TaKaRa)上，轉化入DH5α感受態細胞(TaKaRa)中，最后在含Amp、X-gal及IPTG的LB固體平板培養基上過夜培養，經過藍白斑篩選后，挑取8個白色單菌落，分別置于1.5 ml離心管中培養8 h，將菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

根據測序結果，選取連接轉化成功的菌液擴大培養。培養24 h后，使用Plasmid Mini Kit I (OMEGA)進行質粒標準品DNA提取。DNA提取完成后，使用紫外分光光度計檢測并計算其拷貝數，最后將其稀釋到108copies/μl，–80℃保存備用。

以上所有實驗步驟均按照說明書進行操作。

1.4 樣品采集

為了檢測eDNA在水體中的存留時間，必須保證水體中有一定量的eDNA，且在開始檢測時切斷其eDNA的釋放源頭，以免生物體不斷地向水體中釋放DNA而影響實驗結果。因此，通常是在固定的水體中飼養研究對象一段時間，待水體中eDNA有一定量的積累后將生物體從水體中移除。

本實驗所用水樣取自中國水產科學研究院黃海水產研究所水產遺傳育種中心中國對蝦養殖池(養殖池內只有中國對蝦這單一物種，且養殖池內有足夠量的eDNA)，養殖池長5.5 m、寬3.6 m、高1.2 m，池內水體體積為14 m3，池內有中國對蝦180只，蝦體平均體重為27 g。從池內取25 L水樣用提前消毒的無菌白色塑料桶帶回實驗室，室溫保存，桶內用充氣泵保持充氣直至取樣完畢(有關養殖池信息及中國對蝦體長、體重數據均由遺傳育種中心工作人員測量)。

取樣工作參照Dejean等(2008)的方法并加以改進，每隔24 h從水桶內取15 ml水樣，裝進50 ml無菌離心管內，同時，在離心管內加3 mol/L的醋酸鈉溶液1.5 ml與無水乙醇33 ml，每次取3個平行樣本，–20℃保存直至進行eDNA提取。水樣采集時間為2018年1月12日~2月7日，取樣時間為每天08:00。

1.5 eDNA提取

選用DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Hilden, 德國)試劑盒進行eDNA的提取，提取方法參照Ficetola等(2008)、Dejean等(2008)與Renshaw等(2015)，并進行相應改進，其具體提取步驟為：

將水樣從冰箱拿出，4℃ 9000 g離心1 h。將上一步離心管底部的沉淀物全部刮出，放入2 ml的無菌離心管中，加入570 μl的Buffer ATL與60 μl的蛋白酶K，渦旋震蕩混勻，恒溫水浴3 h直至沉淀物完全裂解，水浴期間，每隔15 min輕輕顛倒混勻離心管以加速裂解，裂解完成后渦旋震蕩15 s。其余步驟按照試劑盒說明書進行，其中，最后一步中DNA的洗脫用60 μl Buffer TE，而非試劑盒中Buffer AE。

eDNA提取完成后，立即使用紫外分光光度計檢測其濃度，若eDNA樣品濃度高于250 ng/μl，則將其進行稀釋。每個eDNA樣品吸取10 μl用作瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR定量分析，其余50 μl eDNA溶液于–80℃保存。

1.6 eDNA的定量分析

所有提取的eDNA樣品采用BBI生命科學有限公司2×Man Fast qPCR Master Mix(Low Rox)實時熒光定量PCR試劑盒進行定量分析。PCR采用20 μl體系：10 μl 2×Man Fast qPCR Master Mix，正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μl，0.4 μl探針(10 μmol/L)，2 μl模板DNA，6.8 μl PCR級水。擴增反應程序采用兩步法：94℃預變性3 min；94℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個循環。

PCR擴增使用ABI 7500型定量PCR儀和96孔板(Thermo Fisher)，標準品DNA與未知濃度eDNA樣品均進行3個重復，每個96孔板進行3個陰性對照(無模板)與3個陽性對照(中國對蝦基因組DNA)，標準品以10倍濃度梯度從107copies/μl稀釋至101copies/μl。實驗數據采用絕對定量法分析，eDNA拷貝數取陽性擴增樣品的平均值，應用系統軟件SDS1.4.0.25自動計算t值及生成標準曲線與擴增曲線。

1.7 數據分析

基于AIC選擇了最適于eDNA隨時間降解的模型(Burnham, 2002; Wickham, 2009)，所有數據使用R3.5.0進行處理，誤差控制在95%的置信區間以內。

2 結果與分析

2.1 引物特異性驗證

PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，引物對COⅠPF/PR與COⅠDF/DR成功擴增出597 bp與106 bp的目的片段，與預期結果完全一致，電泳條帶單一且明亮，無雜帶(圖1)，證明所設計的引物特異性很好。

M: DNA Marker DL 2000；泳道1~4為引物COⅠPF/PR的PCR產物；泳道6~9為引物COⅠDF/DR的PCR產物

M: DNA Marker DL 2000; Lane 1~4: PCR products of COⅠPF/PR; Lane 6~9: PCR products of COⅠDF/DR

2.2 標準曲線建立及回歸方程設定

通過實時熒光定量PCR擴增，PCR檢測系統根據熒光值的變化規律，自動生成中國對蝦COⅠ基因的標準曲線(圖2)。曲線的斜率為=-3.15，相關系數2=0.994，回歸方程為=-3.24+37.47，說明在稀釋的質粒標準品DNA濃度范圍內具有良好的線性關系，表明本研究建立的標準曲線能夠準確地反映中國對蝦COⅠ基因的擴增。

2.3 eDNA檢測

使用紫外分光光度計檢測未知濃度eDNA樣品發現，大部分樣品的260 nm/280 nm值均低于1.8，只有極少數樣品的260 nm/280 nm值在1.8~2.0之間，且eDNA樣品濃度普遍較低，說明水體中eDNA含量較少且水體中雜質較多，因而導致提取的DNA純度較低。

圖2 中國對蝦COⅠ基因AQ-PCR標準曲線

2.4 eDNA降解結果

檢測結果顯示，在eDNA的釋放源頭去除后，隨著時間的推移，水體中eDNA的拷貝數與時間呈負相關關系。第1天(2018年1月12日)檢測時每15 ml水樣中含有的DNA拷貝數為3.76×104，而在第27天(2018年2月7日)檢測時，每15 ml水體中的eDNA拷貝數則降解為711。此外，基于AIC比較了GAM (Gaussian)、GAM(Inverse.Gaussian)、GLM、一元一次回歸及一元二次回歸5種模型對eDNA降解與時間之間的關系的適用性，發現用GAM(Gaussian)模型擬合eDNA降解與時間之間的關系曲線AIC值最小(AIC=472.0694)(表1)，同時，其相關系數2也最高(2=0.984) (圖3)，說明GAM(Gaussian)模型能更好反映eDNA的降解與時間之間的關系。

表1 基于AIC值對模型的選擇

Tab.1 The choice of model based on AIC value

圖3 中國對蝦eDNA降解與時間之間的關系擬合

3 討論

eDNA的檢出率主要取決于釋放速率與降解速率，同時，目標種種群數量的大小對eDNA的檢出率也有一定的影響。此外，除了不可控的自然因素外，一些人為因素也對eDNA檢出率的高低有不可忽視的影響。eDNA從生物體釋放進入水環境后，可能會持續存在，吸附在有機或者無機顆粒上成為沉積物，或者在水環境中逐漸被降解(Levy-Booth, 2007)，影響其降解的因素主要有核酸酶、溫度、pH、紫外光照、水化學及微生物的活動等一系列生物與非生物因素(Barnes, 2014; Strickler, 2015; Tsuji, 2016)。

3.1 長片段eDNA與短片段eDNA在研究中的區別

eDNA由釋放源進入水環境后，隨著時間的變化，一般經過由大片段逐漸分解為小片段直至降解的過程，在這個過程中，根據其環境條件的不同，eDNA在不同環境因子的影響下被加速降解。片段大小為300~400 bp的eDNA在人為實驗控制的條件下能夠在水體中持續存在7 d (Zhu, 2006; Dejean, 2011)，7 d后仍能檢測到的eDNA則為≤100 bp左右的短片段DNA。本研究采用實時熒光定量PCR (TaqMan法)擴增了一段目的片段大小為106 bp的短片段eDNA，檢測了短片段eDNA在水體中滯留時間的長短，結果發現，較長片段eDNA而言，短片段eDNA在水體存留的時間要長很多，其完全降解至少需要30 d，但是，長片段eDNA能夠更加準確地反映最新的生物信息(H?nfling, 2016; Bista, 2017)。同時，這也反映出研究者應該針對自己的最終目的設計實驗，擴增符合需求的eDNA片段，以達到最佳的研究效果。Jo等(2017)設計了1對能夠擴增719 bp的長片段eDNA的引物與1對能夠擴增127 bp的短片段eDNA的引物，分別應用實時熒光定量PCR對竹筴魚()進行了生物量估測及分布監測，表明擴增長片段的eDNA能夠更加精確地評估生物量以及對物種分布做出準確判斷。根據長短片段eDNA在水體中滯留時間的不同，建議在利用eDNA技術進行生物量評估與物種時空動態分布監測時，設計能夠擴增長片段eDNA的引物以擴增來自于生物體最新釋放進入水體的DNA，而不是長期滯留于水體中的DNA，以避免2個資源調查周期之間短片段eDNA的累積效果所導致的實驗誤差。

3.2 不同物種釋放的eDNA在水體中存留時間的區別

一般而言，水生動物釋放的eDNA在水體的存留時間為7~30 d，但不同的生物種類的生活史特征不同，釋放eDNA的速率不同(Minamoto, 2017)，釋放eDNA量的多少與eDNA片段的大小也各不相同(Geerts, 2018)。因此，對不同的物種而言，其釋放的DNA在環境中的存留時間也不同。Thomsen等(2012)研究發現，在飼養鋤足蟾()和冠北螈()時，養殖水體中eDNA的量隨時間不斷增加，但將其移除后，水體中eDNA的量快速下降，7~14 d后，eDNA完全降解；而Goldberg等(2013)以淡水螺()為研究對象，在15℃恒溫條件下飼養淡水螺一段時間后將其移除，發現其釋放到水體中的DNA能夠在環境中存留14~42 d。本研究與前人的研究相比，中國對蝦所釋放的eDNA在水體中的存留時間較長，主要是因為甲殼類的整個生活史過程中存在蛻皮現象，因而其釋放到水中的eDNA的量較大。此外，本研究所取水樣的養殖池中的中國對蝦密度較大，是eDNA在水體中存留時間較長的原因之一。

3.3 環境因子對eDNA存留時間的影響

除了物種本身生活史差異性造成的存留時間不同外，環境因子的變動也會導致eDNA在水體中存留時間的差異。已有研究表明，溫度與eDNA的降解速率呈正相關關系(Strickler, 2015; Lacoursière- Roussel, 2016)。Strickler等(2015)研究了美國牛蛙()釋放到水體中的eDNA分別在5℃、25℃和30℃的條件下的降解情況，發現當環境中eDNA的量相同時，5℃時eDNA的降解最緩慢，主要因為低溫條件下微生物的生長過程較為緩慢，降低了有關生命活動導致的eDNA的降解。本研究所用水體是在冬天室溫(15℃)的情況下保存的，與夏季相比，eDNA的降解速率較為緩慢。因此，對于自然水體而言，隨著季節的交替變化，水溫發生變化，其水環境中的eDNA的降解速率也發生變化。此外，研究表明，pH、紫外輻射以及水化學對eDNA的降解也存在一定的影響(Pilliod, 2013; Barnes, 2014; Eichmiller, 2014、2016a、b)。但是，以上環境因子共同作用時如何影響eDNA的降解尚不清楚。未來在應用eDNA技術準確評估目標種生物量之前，解決上述環境因子對eDNA降解的影響機制至關重要。

4 小結

通過檢測eDNA在水體中的存留時間發現，短片段eDNA在水環境中能夠存留長達30 d左右，可以據此來合理設計實驗方案、確定合適的采樣周期以及尋求妥善的eDNA存儲方法，從而為eDNA技術更有力地應用到水生生態系統的研究領域奠定基礎。

致謝：衷心感謝中國水產科學研究院黃海水產研究所水產動物遺傳育種中心陳寶龍老師與課題組項目聘用人員王惠賓在取樣方面給予的建議與幫助！

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Studying the Retention Time ofeDNA in Water

LI Miao1,3, SHAN Xiujuan1,2①, WANG Weiji1,2, DING Xiaosong1,3, DAI Fangqun1,2, Lü Ding1, WU Huanhuan1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Shandong Provincial Key Laboratory of Fishery Resources and Ecological Environment, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. College of Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Accurate knowledge of species distribution and population dynamics is the basis of conservation biology. However, for certain species that have a special life history and very few populations, species distribution detection becomes extremely difficult. The combination of DNA barcode technology and environmental DNA (eDNA) has solved these difficulties. Currently, this method has been applied successfully to biological testing, biodiversity assessment, biomass assessment, fish migration, and other research. Given the ease of degradation of eDNA and its low level in the environment, exploring its persistence in the environment is critical for accurate qualitative and quantitative analysis. In this study,was used as the research subject. The degradation of eDNA in a water environment was quantitatively analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. The relationship between eDNA degradation rate and time was explored. The most suitable eDNA was selected based on Akaike Information Criterion (AIC). A statistical model of degradation of eDNA over time was used. The experimental results showed that the level of eDNA in water is negatively correlated with time. After the source of eDNA was removed, its residence time in the environment was about one month. The aim of this research was to provide a theoretical basis for the qualitative detection and quantitative assessment of rationally planned species, with a view to minimizing experimental error caused by human factors.

Environmental DNA; Retention time;

S931

A

2095-9869(2020)01-0051-07

10.19663/j.issn2095-9869.20180906005

* 國家重點研發計劃(2017YFE0104400)、國家重點基礎研究發展計劃(2015CB453303)、山東省泰山學者專項基金項目和青島海洋科學與技術試點國家實驗室鰲山人才培養計劃項目(2017ASTCP-ES07)共同資助 [This work was supported by the National Key R&D Program of China (2017YFE0104400), the National Basic Research Program of China (2015CB453303), Special Funds for Taishan Scholar Project of Shandong Province, and Aoshan Talents Cultivation Program Supported by Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao) (2017ASTCP-ES07)]. 李 苗，E-mail: limiao0417@126.com

單秀娟，研究員，E-mail: shanxj@ysfri.ac.cn

2018-09-06,

2018-12-05

http://www.yykxjz.cn/

李苗, 單秀娟, 王偉繼, 丁小松, 戴芳群, 呂丁, 吳歡歡. 環境DNA在水體中存留時間的檢測研究——以中國對蝦為例. 漁業科學進展, 2020, 41(1): 51–57

Li M, Shan XJ, Wang WJ, Ding XS, Dai FG, Lü D, Wu HH. Studying the retention time ofeDNA in water. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 51–57

SHAN Xiujuan, E-mail: shanxj@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)