海帶孢子體、配子體時期附生菌群落結(jié)構(gòu)的比較*

唐隆晨 鐘晨輝 林 琪 陸 振 黃瑞芳 宦忠艷

海帶孢子體、配子體時期附生菌群落結(jié)構(gòu)的比較*

唐隆晨 鐘晨輝 林 琪①陸 振 黃瑞芳 宦忠艷

(福建省水產(chǎn)研究所 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室 廈門 361000)

為探究海帶()生活史孢子體、配子體不同階段的附生菌群落結(jié)構(gòu)的差異，采用Illumina測序技術(shù)，分析了種海帶(S1)、配子體(S2)、幼孢子體(S3)和大孢子體(S4)這4個不同階段的藻體上附生菌16S rRNA序列，研究其附生菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，4個階段共識別出23門156屬共244個操作分類單元(OTU)。從門分類上來說，變形菌門(Proteobacteria)在海帶各階段中均表現(xiàn)出較高的豐度，在S1、S2、S3和S4藻體樣本中相對豐度分別達53.0%、94.3%、77.2%和36.7%，藍細(xì)菌門(Cyanobacteria)只在S4藻體樣本中表現(xiàn)出較高的豐度，為43.8%；從屬分類上來說，假交替單胞菌屬()在各樣本間差異較大，S2、S3和S4樣本中相對豐度分別為65.00%、44.88%和25.57%，但在S1樣本中僅為0.18%。各樣品間附生菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，S1與S4樣本相鄰聚為一支，S2與S3樣本為另一支。S2樣本的菌群種類單一且分布不均勻，S1、S3與S4樣本細(xì)菌種類豐富，但S4樣本中菌群間的豐度差異較大。海帶的苗種繁育階段(S2和S3)存在褐藻酸降解菌豐度增加的趨勢，孢子體階段(S4)則具有高豐度的共生型藍細(xì)菌。

海帶；附生菌；16S rRNA；褐藻酸降解菌；藍細(xì)菌門

海藻與細(xì)菌間關(guān)系復(fù)雜，既相互利用(Berg, 2002; Hodson, 2007; Amin, 2015)，又相互制約(Manage, 2001; 林偉等, 2000)。有相當(dāng)一部分的海洋藻類在合成生長所必需的維生素B12時，需要通過細(xì)菌提供一種輔酶(Croft, 2005)，但在海洋環(huán)境中某些營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，細(xì)菌又會成為藻類的營養(yǎng)競爭者，進而抑制藻類生長(Rier, 2002)。大型海藻與附生菌之間的關(guān)系平衡對于大型海藻的健康生長至關(guān)重要，平衡一旦被打破，會影響到海藻的正常生長發(fā)育，有時也會產(chǎn)生病害(沈梅麗等, 2013)。人工養(yǎng)殖的海帶表面附生的褐藻酸降解菌，在水溫升高或海帶養(yǎng)殖密度過高時大量繁殖，造成海帶發(fā)生病爛(陳騳等, 1979、1981、1984)。因此，分析海帶附生菌的群落結(jié)構(gòu)，對防止海帶病害的發(fā)生，確保產(chǎn)量具有重要的意義。

海帶主要用于食品、保健品、工業(yè)原料及生物餌料等(張杰, 2016)，其生活史由大型葉狀孢子體(2)和微型絲狀配子體()組成(李靜, 2015)?；【鷮?)、鹽單胞菌屬()、假交替單胞菌屬()、芽孢桿菌屬()等被發(fā)現(xiàn)存在于海帶表面，部分種類與海帶病爛有關(guān)，不同海域的海帶附生菌群結(jié)構(gòu)存在差異(Duan, 1995; Wang, 2008; Sun, 2017; Wang, 2017)。近年來，隨著二代測序技術(shù)應(yīng)用于海洋微生物群落的分析，可有效、快捷地進行其分型和豐度分析(孫超等, 2014; 李俊峰, 2015; 劉文亮等, 2017)。本研究基于第二代測序技術(shù)，研究海帶孢子體、配子體附生菌的群落結(jié)構(gòu)，旨在為海帶苗種繁育與養(yǎng)殖提供監(jiān)測數(shù)據(jù)，也為海帶病害的預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本采集和前處理

海帶樣本為福建傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系，2016年4月采自福建霞浦縣下滸鎮(zhèn)池澳村的海帶養(yǎng)殖筏架，并于室內(nèi)留種室培養(yǎng)至孢子囊成熟(圖1a)。雌、雄配子體由種海帶放散游孢子后獲得，分離并保存于實驗室內(nèi)(圖1b)。海帶幼孢子體由雌配子體卵細(xì)胞與雄配子體放散的精子經(jīng)過受精作用產(chǎn)生(圖1c)。養(yǎng)殖區(qū)海帶大孢子體是由幼孢子體下海養(yǎng)殖至次年4月的厚成期健康葉狀體(圖1d)。各生活史階段的樣本及處理方法如表1所示，除配子體用無菌海水保存外，其余樣本處理前均經(jīng)滅菌海水清洗數(shù)遍去除表面雜質(zhì)。

圖1 不同生活史階段的藻體樣本

A、B、C和D分別為種海帶(S1)、配子體(S2)、幼孢子體(S3)和大孢子體(S4)

A, B, C, and D showing the samples of mature sporophytes (S1), gametophytes (S2), sporelings (S3) and big sporophytes (S4), respectively

表1 樣本類型、來源、環(huán)境溫度及前處理方法

Tab.1 The types, source, environmental temperature and pre-processing methods of samples

1.2 DNA提取、序列擴增和測序

按照基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)說明書要求，提取保存的海帶基因組DNA，以制備基因組DNA為模板，使用16S rRNA通用引物338F(5￠-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3￠)和806R(5￠-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3￠)擴增目標(biāo)DNA片段(Xu, 2016)。使用低循環(huán)數(shù)擴增，并保證每個樣本擴增的循環(huán)數(shù)一致。20 μl PCR擴增體系的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共27個循環(huán)；72℃后延伸10 min。每個樣本設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測后，收集、純化，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Mothur軟件和Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計 與分析。以97%相似性為標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，統(tǒng)計各樣本的群落組成，并基于OTU結(jié)果計算樣品的Alpha多樣性，包括香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、辛普森指數(shù)(Simpson index)、物種豐富度指數(shù)(Abundance based coverage, ACE)等(許燕等, 2018)。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物質(zhì)量檢測

用海帶制備基因組DNA，以16S rRNA通用引物擴增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，條帶清晰明亮，可用于后續(xù)的測序分析。

1、2、3和4：S1、S2、S3和S4樣本；CK：空白對照組；M：Marker 2000

1, 2, 3, and 4: S1, S2, S3, and S4 samples, respectively; CK: Control check; M: 2000 DL Marker

2.2 測序深度和測序覆蓋度

海帶4個樣本經(jīng)高通量測序及序列優(yōu)化后，共獲得156950條有效序列，平均長度為442 bp，絕大部分的有效序列長度為421~460 bp，占99.96%。各樣本合計識別出244種OTU，對測序覆蓋度進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，各樣本OTU觀察數(shù)已達到飽和(Good′s coverage>0.999)，該測序深度能夠較全面地反映海帶在不同生活史階段附生菌的生物群落結(jié)構(gòu)(表2)。

表2 各樣本測序結(jié)果統(tǒng)計

2.3 附生菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對豐度

將海帶4種孢子體、配子體樣本的16S rRNA測序結(jié)果，與Silva數(shù)據(jù)庫上的參考序列比對注釋，統(tǒng)計不同OTU所對應(yīng)的門、屬及其相對豐度，共識別出23門156屬。其中，變形菌門(Proteobacteria)在各生活史階段的群落中均占據(jù)優(yōu)勢，在S1、S2、S3和S4樣本中分別占53%、94.3%、77.2%和36.7%(表3)，而擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細(xì)菌門(Cyanobacteria)及疣微菌門(Verrucomicrobia)在整個群落結(jié)構(gòu)中的比例，在海帶孢子體、配子體中有較大差異。S1樣本中擬桿菌門占40.0%，S4樣本中則只有1.9%；藍細(xì)菌門和疣微菌門在S4樣本中分別占43.8%和16.5%，但在S2樣本中并沒有識別出來。除了這4個相對豐度較高的細(xì)菌門類以外，酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等多種門類的細(xì)菌也被識別到，但相對豐度極低。

表3 海帶不同生活史階段附生菌中優(yōu)勢細(xì)菌門類及相對豐度

Tab.3 Dominant bacterial phyla and the relative abundance of bacterial communities at different stages of life cycle in Saccharina japonica

在屬水平上對各樣本附生菌群落結(jié)構(gòu)及相對豐度進行統(tǒng)計分析(圖3)，結(jié)果顯示，4個樣本間的附生菌群落結(jié)構(gòu)及相對豐度存在較大差異。在S1樣本中，細(xì)菌屬類豐富，并未存在絕對優(yōu)勢的細(xì)菌屬，豐度最高的為科爾韋爾氏菌屬()，占21.28%，其次是黃桿菌科(Flavobacteriaceae)中的未鑒定屬，為19.37%，而有16個屬的細(xì)菌豐度在1%~10%之間，假交替單胞菌屬()的相對豐度為0.18%；S2樣本附生菌種類相對單一，假交替單胞菌屬以65.00%的相對豐度占據(jù)了絕對優(yōu)勢，其次為屬，占10.32%，剩下各屬中只有6個的相對豐度>1%；在S3樣本中，假交替單胞菌屬依然為優(yōu)勢群體，占44.88%，其次為多毛桿菌屬()，為8.71%，其余各屬中有12個類群相對豐度在1%~10%之間。S4樣本，藍細(xì)菌中的未分類屬為優(yōu)勢類群，占43.80%，其次為假交替單胞菌屬，為25.57%，之后為屬，占16.49%，其余各屬中只有3個屬的相對豐度超過1%。

圖3 海帶不同生活史階段附生菌中屬水平種群結(jié)構(gòu)及相對豐度

2.4 海帶孢子體、配子體階段附生菌群落的多樣性、相關(guān)性及主成分分析

為探究海帶不同生活史階段附生菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性的差異，基于測序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計了ACE、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)(表4)。結(jié)果顯示，在S1與S3樣本中，無論是物種豐富度還是物種多樣性，均呈現(xiàn)出較高的水平，S1樣本代表物種豐富度的ACE和Chao指數(shù)分別為164和145，代表物種多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)分別為3.35和0.058；S3樣本中這4個指數(shù)分別為190、189、2.81和0.194。S2樣本物種豐富度和多樣性則相對較低，其ACE、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)分別為64、63、1.65和0.378；在S4樣本中，代表物種豐富度的ACE和Chao指數(shù)均較大，分別為172與172，然而，代表物種多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)則表現(xiàn)為Shannon指數(shù)較小(1.9)、Simpson指數(shù)較大(0.271)，呈現(xiàn)出菌群種類豐富但菌種間分布上的不均勻性。

表4 海帶不同生活史階段附生菌群落的Alpha多樣性

Tab.4 Alpha diversity of bacterial communities during different life stages in Saccharina japonica

進一步篩選各樣品中相對豐度大于1%的31個屬所包含的62個OTU，構(gòu)建了包含樣本聚類關(guān)系樹的熱圖。如圖4所示，不同的顏色代表不同的相對豐度，頂端為樣本聚類關(guān)系樹。S1與S4樣本聚為一類，S2和S3樣本聚為一類。同時，根據(jù)OTU組成，對各樣本間附生菌群落差異和距離進行主成分分析，結(jié)果如圖5所示。PC1軸對樣本的貢獻率為54.32%，PC2軸對樣本的貢獻率為26.36%，4個樣本分別落在圖中4個不同的象限上，各樣品間表現(xiàn)出較大的差異性。

選取各樣本OTU的并集，根據(jù)樣本間附生菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的相互關(guān)系，繪制Venn圖(圖6)。結(jié)果顯示，在這4個樣品中，分別有131、61、178和161個OTU被識別出來，配子體階段樣本要少于孢子體階段樣本。其中，有22個OTU在4個樣品中均存在，并分別占各樣品OTU總數(shù)的16.8%、36.1%、12.4%和13.7%。在孢子體階段(S1、S3和S4)，有52個OTU普遍存在，分別占到S1、S3和S4樣本中OTU總數(shù)的39.7%、29.2%和32.3%，且在配子體(S2)樣本中未被檢測到；5個OTU為配子體階段特有，占S2樣本中OTU總數(shù)的8.2%。

圖4 各樣品中相對豐度高于1%的屬的OTU分布熱圖

圖5 不同樣本的主成分分析

3 討論

本研究針對海帶、配子體、幼孢子體及大孢子體4個不同階段樣本，進行附生菌群落結(jié)構(gòu)分析，證實在海帶生活史的不同階段，附生菌群落結(jié)構(gòu)有一定差異。變形菌門在種海帶、配子體、幼孢子體的時候均占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)出超過50%的豐度，但在大孢子體中，豐度最高的則是藍細(xì)菌門。在配子體中，細(xì)菌種類少且屬間分布不均勻，這可能與海帶配子體在低溫、低光強及封閉培養(yǎng)條件下有關(guān)，種海帶、幼孢子體和大孢子體則處于開放的海水環(huán)境，表現(xiàn)出豐富的細(xì)菌種類。但養(yǎng)殖條件下的大孢子體的附生菌群多樣性水平較低。

圖6 各樣品中附生菌多樣性的相關(guān)性分析

褐藻酸降解菌是一類在海帶養(yǎng)殖過程中廣泛分布于養(yǎng)殖水體及藻體表面的具有降解褐藻酸能力的細(xì)菌，主要有假交替單胞菌屬、交替單胞菌屬()、弧菌屬()、糖噬胞菌()、黃桿菌屬()中的許多種類(Li, 2011; Wang, 2008; 侯士昌等, 2014; 傅曉妍等, 2007)。這些褐藻酸降解菌是條件致病菌，通常情況下并不引起病害，但若養(yǎng)殖環(huán)境惡化，細(xì)菌侵入并大量繁殖，則可致病(陳騳等, 1981)。本研究中，假交替單胞菌屬相對豐度高，且在不同生活史階段差異極大。配子體階段與幼孢子體階段其相對豐度分別為65.00%和44.88%，海區(qū)養(yǎng)殖的大孢子體中，其相對豐度為25.57%，而在種海帶階段，則只有0.18%，這可能與種海帶入庫前經(jīng)清洗并切除常發(fā)病害的梢部和邊緣部而只保留中帶部有關(guān)。幼孢子體階段是海帶夏苗培育的關(guān)鍵期，苗過密、高溫等均能引發(fā)假交替單胞菌屬的大量繁殖，從而導(dǎo)致爛苗、掉苗等(陳騳等, 1984)。因此，嚴(yán)格挑選、處理種海帶，處理育苗冷水，控制育苗密度，及時清理脫落幼孢子體，對減少育苗中有害細(xì)菌的大量增殖具有重要意義。

本研究中，藍細(xì)菌門僅檢測到一個未知種類的OTU信息。這個OTU在配子體階段未被檢測到，幼孢子體時期開始出現(xiàn)一定的豐度，海區(qū)養(yǎng)殖大孢子體的相對豐度很高，并成為優(yōu)勢菌群，而進入成熟期形成種海帶后，豐度又逐漸降低。推測該OTU的相對豐度在各生活史階段可能與海帶的生物量積累速度有關(guān)聯(lián)。在種海帶與大孢子體中，該OTU相對豐度差異很大，且在配子體階段并未檢測到豐度，該OTU信息很有可能來自于某種未知的共生型藍細(xì)菌，且在較低的溫度條件下，其生長會受到抑制(Gerard, 1990)。這里所檢測出的藍細(xì)菌門種類在與海帶的共生關(guān)系中究竟起著怎樣的作用，有待深入研究。

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Comparative Study on the Community Structure of Epiphytic Bacteria in Sporophyte and Gametophyte Stages of Kelp

TANG Longchen, ZHONG Chenhui, LIN Qi①, LU Zhen, HUANG Ruifang, HUAN Zhongyan

(Fisheries Research Institute of Fujian, Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Xiamen 361000)

To explore the community structure of epiphytic bacteria on the sporophytes and gametophytes of kelp, sequences of 16S rRNA of epiphytic bacteria found on the mature leafy sporophytes (S1), filamentous gametophytes (S2), sporelings (S3), and big leafy sporophytes (S4) were analyzed using Illumina sequencing technology. The results showed that 23 phyla, 156 genera, and 244 kinds of OTUs (Operational Taxonomic Units) were identified in these samples. At the phylum level, Proteobacteria showed higher abundance, with relative abundances of 53.0%, 94.3%, 77.2%, and 36.7% in S1, S2, S3, and S4 samples, respectively. Cyanobacteria showed higher abundance of 43.8% in S4 samples only. At the genus level, the relative abundances ofin S2, S3, and S4 were 65.00%, 44.88%, and 25.57%, respectively, but only 0.18% in S1. The community structure of epiphytic bacteria varied greatly among samples. S1 and S4 samples were clustered together, but S2 and S3 samples were clustered in another branch. The species of the bacteria in S2 samples were single and unevenly distributed. S1, S3, and S4 samples were rich in bacteria, while the relative abundance between different bacteria in S4 samples varied greatly compared to that in other samples. This study revealed that there was an increasing trend in the abundance of alginic acid-degrading bacteria during the breeding stage of(S2, and S3), and there was a high abundance of symbiotic Cyanobacteria in the big leafy sporophyte stage (S4).

; Epiphytic bacteria; 16S rRNA; Alginic acid degrading bacteria; Cyanobacteria

S946.1

A

2095-9869(2020)01-0058-08

10.19663/j.issn2095-9869.20181011001

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-50)、福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目(2017FJSCZY01)和廈門南方海洋研究中心項目(15GZY021NF04)共同資助 [This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-50), Seed Industry Innovation and Industrialization Project of Fujian Province (2017FJSCZY01), and Southern Oceanographic Center Project of Xiamen (15GZY021NF04)]. 唐隆晨, E-mail: 350060372@qq.com

林 琪，E-mail: xmqlin@sina.com

2018-10-11,

2018-10-26

http://www.yykxjz.cn/

唐隆晨, 鐘晨輝, 林琪, 陸振, 黃瑞芳, 宦忠艷. 海帶孢子體、配子體時期附生菌群落結(jié)構(gòu)的比較. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(1): 58–65

Tang LC, Zhong CH, Lin Q, Lu Z, Huang RF, Huan ZY. Comparative study on the community structure of epiphytic bacteria in sporophyte and gametophyte stages of kelp. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 58–65

LIN Qi, E-mail: xmqlin@sina.com

(編輯 馮小花)