高溫脅迫條件下大菱鲆腎臟轉錄組研究*

楊 凱 黃智慧 馬愛軍 劉曉菲 楊雙雙

高溫脅迫條件下大菱鲆腎臟轉錄組研究*

楊 凱1,2,3黃智慧1,3馬愛軍1,3①劉曉菲1,3楊雙雙1,3

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 山東省海洋漁業生物技術與遺傳育種重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室 青島 266071; 2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306; 3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266071)

為探索大菱鲆()耐高溫的分子機制，篩選耐高溫相關基因，采用高通量測序平臺(IlluminaHiSeq-2500)分別對5個不同高溫處理組的大菱鲆腎臟組織開展轉錄組測序，進行生物信息學分析，包括GO(基因功能注釋)、SSR(簡單重復序列)分析等。結果顯示，通過組裝得到Unigenes總數目為68525，長度范圍為201~23456 bp，平均長度為1124 bp，N50長度為2316 bp。將Unigenes分別在Nr、Swissprot、KEGG、KOG、GO數據庫進行序列比對及功能注釋，共注釋25498條，其中，Nr數據庫注釋到的Unigenes最多；按GO功能分類，共分為細胞組分、分子功能及生物學過程3類，包括56個功能組，其中，大量Unigenes與細胞進程、代謝過程、催化活性、生物調節、應激反應相關。將Unigenes進行pathway注釋，歸屬于218條代謝通路，分為5類KEGG途徑：代謝途徑、遺傳信息處理、細胞過程、環境信息和生物系統。進行轉錄因子分析，共檢測到65類轉錄因子，其中，C2H2鋅指蛋白家族的基因數目最多。通過對不同溫度脅迫下基因表達譜結果進行分析，不同溫度組之間存在著顯著差異，在不同溫度脅迫組中，20℃組與28℃組存在差異最大，差異基因達到4734個，其中，上調基因3386個，下調基因1348個。本研究建立了大菱鲆熱應激腎臟轉錄組數據庫，為大菱鲆高溫脅迫分子機理研究提供了參考數據。

大菱鲆；腎臟；高溫脅迫；轉錄組；生物信息學分析

大菱鲆()為我國北方沿海工廠化養殖業的主導品種之一(雷霽霖等, 2002)。大菱鲆為冷溫性魚類，對溫度等環境指標要求較嚴，適宜生長水溫為12℃~19℃；通常在良好的充氣和流水條件下，耐受高溫可達25℃~26℃(馬愛軍等, 2012)，但對夏季高溫耐受能力較差。因受水溫條件限制，我國北方主要采用“養殖大棚+深井海水”模式進行養殖，但近年來，隨著地下海水的匱乏，南北接力養殖模式的出現，養殖生產中對大菱鲆耐高溫新品種的需求日益增加(關健等, 2013)。另外，應用分子生物學手段，加快開展大菱鲆耐熱性狀的分子機制研究，對于培育耐高溫的養殖品種具有較大意義。

轉錄組是指生物體的細胞或組織在特定的狀態下基因組所轉錄的全部mRNA，反映了基因在不同生命階段、生理狀態、組織類型以及環境條件下表達的情況(羅輝等, 2015)。生物抗逆性受多個信號轉導途徑的調控，需要多基因協同表達(崔文曉等, 2017)，因此，開展轉錄組測序分析，篩選關鍵信號通路及主效基因、轉錄因子等，并利用關鍵轉錄因子的調控作用促使多個功能基因表達來提高魚類機體的抗逆性，是一種非常有效的方法和途徑。近年來，從轉錄水平分析生物對環境脅迫的分子響應機制的相關研究屢見不鮮。如在水生生物中，Bilyk等(2014)利用轉錄組測序分析，探索了博氏南冰鰧()應對溫度脅迫的分子機制，并首次推測性別會影響魚類應對溫度脅迫時基因的轉錄；Huang等(2018)在熱應激條件下對虹鱒魚()頭腎進行了轉錄組表達譜研究，但僅開展了常溫組(18)、高溫組(24) 2個溫度點的比較分析。

本研究為了盡可能完整、系統地獲得熱應激對大菱鲆腎臟影響的數據信息，通過增加溫度點，對頭腎組織進行轉錄組測序和生物信息學分析，包括基因功能注釋、SSR(簡單重復序列)分析等，探討差異基因的表達情況，為建立大菱鲆熱應激條件下的物質代謝途徑，構建信號轉導通路模型，及發掘新的耐溫基因提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 養殖實驗及樣品采集

實驗用大菱鲆養殖于山東省煙臺市開發區天源水產有限公司，均為人工繁育的健康幼魚。幼魚為隨機挑選，平均體重為(100±12.3) g，于實驗室玻璃水缸(1 m直徑, 1 m深)暫養7 d。根據實驗經驗，共設計5個實驗溫度：(13±1)℃(常溫CT)、20℃(T1)、23℃(T2)、25℃(T3)和28℃(T4)。升溫方法參照Diegane等(2007)并優化：從常溫(13±1)℃按每12 h增加1℃的速度升高至實驗水溫，每個處理組設3個平行組，每組投放15尾大菱鲆幼魚。馴養與實驗期間，每日早晚各投喂1次自制人工餌料，并換水1次。采用靜水法，自動恒溫加熱器控溫；到達實驗溫度并維持12 h后，每個平行組取3尾魚體腎臟組織，即每個處理組共取9尾幼魚，將9個樣本放入1.5 ml EP管中用液氮速凍，置于–80℃保存備用。

1.2 RNA提取

將對照組及處理組中的每個平行組的3個樣本混合均勻后，提取樣品總RNA，即每組處理3份生物學重復。提取方法：取腎臟組織在液氮中研磨成粉末，用動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)提取總RNA。用NanoDrop 2000核酸檢測儀(Thermo公司, 美國)檢測RNA純度，用核酸分析儀Agilent2100 (安捷倫科技公司, 美國)檢測總RNA濃度及RNA質量。

1.3 腎臟轉錄組文庫構建及測序

RNA-Seq文庫制備及測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測序平臺為Illumina HiSeqTM2500，采用雙末端測序方法。

1.4 序列拼接與功能注釋、富集

去除原始序列數據中含有接頭及低質量的序列后，得到Clean reads，并進行De novo組裝。使用短reads組裝軟件Trinity將轉錄組從頭組裝成Unigenes數據集。通過blastx將Unigenes序列比對到Nr、SwissProt、KEGG和COG，得到Unigenes的蛋白功能注釋信息。對所有Unigenes進行GO功能分類統計、KEGG Pathway注釋及通路富集分析。

1.5 預測編碼蛋白框和轉錄因子

按Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG/KOG的優先級順序將Unigenes序列與以上蛋白庫做blastx比對(E值<1×10–5)，利用Hmmsearch將Unigenes的ORF比對到TF數據庫(Animal TFdb)預測TF，并將預測的TF按照家族類型分類。

1.6 微衛星(SSR)分析

簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)又稱微衛星DNA，利用MISA軟件對轉錄組的所有Unigenes進行搜索，查找SSR。搜索標準為：單、一、二、三、四、五、六核苷酸基序(Motif)至少重復次數分別為10、8、5、4、3、3，對查找的SSR類型進行特征分析(賈新平等, 2014)。

1.7 基因表達差異分析

Unigene表達量的計算使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)計算，RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因表達差異。分組之間的差異基因統計，利用FDR與log2FC篩選，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1，其中，FC (Fold Change, FC)標示兩樣品間表達量的比值。得到差異表達基因之后，對差異表達基因進行GO功能富集分析，KEGG Pathway注釋及通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 轉錄組數據組裝

利用Illumina Hiseq 2500高通量測序技術對大菱鲆不同溫度脅迫條件下腎臟組織開展轉錄組測序分析，1個對照組與4個實驗溫度組共獲得Raw reads及去除雜質后的Clean reads (表1)。由表1可以看出，共得到224,473,610個Clean reads片段，包含了99.7 Gb的序列信息，GC%含量平均值為51.05%。在測序質量值統計評估方面，堿基Q30為88.65%，由以上數據得出，該轉錄組測序數據量和質量都較高，可為后續的組裝提供可靠的原始數據。

采用Trintiy軟件對Clean reads組裝，共獲得Unigenes總數目為68525，長度范圍為201~23456 bp，平均長度1124 bp，N50長度2316 bp。組裝數據統計見表2。Unigenes長度分布圖見圖1，結果顯示，組裝完整性較高，從而為后續信息學注釋及差異基因的篩選奠定了基礎。

表1 大菱鲆高溫脅迫轉錄組測序數據統計

Tab.1 Statistics of transcriptome sequencing data of heat stress of turbot

表2 大菱鲆高溫脅迫轉錄組組裝數據統計

Tab.2 Statistics of transcriptome assembly data of heat stress of turbot

圖1 Unigene長度分布

2.2 大菱鲆腎臟轉錄組Unigenes的功能注釋、分類和代謝途徑分析

2.2.1 Unigenes的注釋及序列相似性分析 將Unigenes分別在Nr、Swissprot、KEGG、KOG、GO數據庫進行序列比對及功能注釋，共注釋25498條Unigenes。其中，Nr數據庫注釋到的Unigenes數量最多，具體結果分別為：Nr庫25442條，Swissprot庫21179條，KEGG庫15488條，KOG庫17111條，Go庫12760條(表3)。

表3 Unigene的注釋結果

Tab.3 The result of Unigene′s annotation

利用Blastx將組裝出來的Unigene序列與Nr數據庫進行比對，結果顯示，功能注釋匹配的物種中，大黃魚()所占的比例最高(29.2%)，隨后依次是雀鯛() (23.1%)、羅非魚() (5.3%)、革首南極魚() (4.7%)、半滑舌鰨() (4.7%)等物種。

2.2.2 Unigenes的GO分類 采用Blast2Go軟件，結合GO數據庫對大菱鲆的Unigene進行功能分類，從宏觀上分析大菱鲆熱應激脅迫后表達基因的功能分布特征。在Go分類體系中，共有3個Ontology，分別描述基因的生物學過程(Biological process)、細胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。結果表明，共有12760條Unigenes獲得GO注釋，劃分為56個功能組，并對每個功能組涉及的Unigene進行統計分析(圖2)。注釋到Molecular function上的基因數目最多，為10053個，其次是Biological process 9644個，Cellular component 6270個。其中，細胞進程6041個，單生物代謝過程5240個，代謝過程4842個，催化活性4681個，細胞3874個，生物調節3535個，應激反應1840個和信號轉導1334個功能組中涉及的Unigenes較多。這一分類結果顯示了大菱鲆熱應激過程中基因表達譜的總體情況。

2.2.3 Unigenes的KOG功能分類 蛋白質直系同源數據庫(COG/KOG)對基因產物進行直系同源分類。研究顯示，大菱鲆腎臟轉錄組共獲得17111個注釋信息，可歸屬于25類，并對每類Unigenes進行統計分析。其中，信號轉導機制為8661個，一般功能預測為6528個，翻譯后修飾、蛋白質折疊和分子伴侶為3346個，轉錄為2435個，細胞內轉運、分泌和小泡運輸為2174個，細胞構架為1925個，其他類別的基因表達豐度均各不相同(圖3)。

2.2.4 Unigenes的KEGG分析 結合KEGG數據庫注釋信息，進一步將大菱鲆腎臟Unigenes進行Pathway注釋，其中，有15488個Unigenes獲得對應的Ko編號，歸屬于218條代謝通路，分類為5類KEGG途徑：代謝途徑、遺傳信息處理、細胞過程、環境信息和生物系統。其中，代謝途徑主要包括碳水化合物代謝通路、氨基酸代謝通路、能量代謝通路、脂類代謝通路、核苷酸代謝通路等，占據KO注釋Unigenes的25.4%(3941條)；遺傳信息處理主要包括翻譯，折疊、分選和相互作用，轉錄，復制和修復等，共注釋到1907條Unigenes，占12.3%；細胞過程主要由轉運和代謝作用，細胞生長與死亡，運輸分解代謝，細胞連接等組成，共注釋到2927條Unigenes，占18.9%；環境信息主要包括信號轉導，信號分子與相互作用，共注釋3230條Unigenes，占20.8%；此外2161條Unigenes被注釋到生物系統中。Unigenes數量最多的20個代謝途徑見圖4，涉及細胞內吞、信號轉導、能量代謝、循環系統、細胞連接等。

2.3 CDS分析

通過Blast比對得到CDS核酸和氨基酸序列分布，ESTscan預測編碼區的核酸和氨基酸序列的長度分布(圖5)。

2.4 Unigenes的轉錄因子分析

轉錄因子是能夠結合在基因上游特異的核苷酸序列上的蛋白質，能調控其靶基因的轉錄。對大菱鲆腎臟Unigenes進行轉錄因子分析，共檢測到65類轉錄因子。其中，C2H2鋅指蛋白家族的基因數目最大，達到429個Unigenes；調節動物生長發育、響應逆境脅迫相關的Homeobox同源異位基因，有101個Unigenes；與Bhlh家族相關的有86個Unigenes；參與抗逆響應的TF-Bzip家族相關的Unigenes有83個；參與組織損傷修復、細胞遷移、再生等生命進程的HMG基因有55個Unigenes；MYB家族42個，ZBTB家族38個；Fork-head家族34個，THR-like家族33個；其余家族基因數目相對較少。

圖2 Unigenes的GO功能分類圖

圖3 Unigenes的KOG功能分類

圖4 Unigenes的KEGG功能分類

圖5 CDS分析

2.5 SSR分析

對大菱鲆腎臟轉錄組的68525條Unigenes進行SSR位點搜索，共檢測到21177個SSR位點。SSR類型豐富，其中，包括二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復，各堿基重復數量分別為1100、7604、1941、393和231個。

2.6 基因在大菱鲆不同溫度脅迫中的表達分析

對5組不同高溫脅迫環境(CT: 常溫, T1: 20℃, T2: 23℃, T3: 25℃, T4: 28℃)的基因進行表達比較分析，結果顯示(圖6)，CT組同4個高溫組均表現出較大的差異，而且上調基因占較大比重；T1組與T4組存在較大的差異，差異基因達到4734個，其中，上調基因3386個，下調基因1348個；T1與T3組差異表達基因163個，其中，上調基因131個，下調基因32個；T2與T4組差異基因4157個，其中，上調基因2691個，下調基因1466個；T3與T4組差異表達基因2501個，其中，上調基因1673個，下調基因828個；而T1與T2組、T2與T3組的差異表達基因較少，分別為25和36。

圖6 差異基因統計

3 討論

作為變溫性動物，魚類對環境溫度等指標要求較嚴，其中，熱應激是影響魚體生長發育最嚴重的環境脅迫(周朝偉等, 2018)，魚類在長期進化過程中對熱應激的響應形成了一套完善的應答協調機制，因此，揭示其熱應激脅迫的分子機制，培育出耐高溫的新品種，在目前全球氣候變暖的背景下顯得尤為迫切。

轉錄組高通量測序是功能基因組研究的一個重要技術手段，通過數字基因表達譜技術，可以將不同組織、各個發育階段以及逆境脅迫下的差異表達基因快速檢測出來，在功能基因組學研究方面正在發揮著重要的作用(王申昌等, 2016)。該技術目前在水產動物中的應用顯著增加，對于魚類疾病、免疫、生長、抗逆、系統進化和生物毒理過程及機理等方面的研究都有極大幫助(陳瓊等, 2014; 陳之航等, 2017)。為盡可能完整、系統地獲得熱應激對大菱鲆腎臟影響的轉錄組數據信息，本研究選取5個不同的溫度梯度處理，開展了大菱鲆高溫脅迫轉錄組分析。

通過對不同溫度脅迫下基因表達譜結果進行分析，不同溫度組之間存在較顯著的差異，尤其是CT、T1、T3和T4組，4個溫度組的差異表達基因較多，而T2與T1、T3組之間的差異基因個數較少。我們推測，隨著溫度的升高，魚體的生理機能發生不斷的變化從而適應脅迫，當到達某個溫度區域時，機體將處于一個平衡態，機體變化相對較小，但如果溫度繼續升高，則打破這一平衡，繼續調整，從而適應脅迫。

逆境條件下，許多脅迫相關基因在轉錄水平都會有所增加，其主要原因是轉錄因子對目標基因啟動子的順式作用元件的特異結合(趙麗娟等, 2016)。本研究對大菱鲆腎臟熱應激轉錄因子進行了分析，共檢測到65類轉錄因子，為深入研究大菱鲆熱應激適應機制提供分子基礎和依據。其中，C2H2鋅指蛋白家族的基因數目最多，其又稱為TFIIIA類型的鋅指蛋白(TFIIIA因子是RNA聚合酶III轉錄5S rRNA基因所必需)，在真核細胞中廣泛富集的鋅指蛋白之一(Laity, 2001)。在植物中研究較多，主要參與脅迫應答信號轉導和細胞過程，如ZAT7基因在鹽脅迫下的表達主要在根中有所增高(Yilmaz, 2007); TFⅢA型鋅指蛋白SCOF-1，作為冷調控基因(Cold-regulated, COR)的正調節物，通過與脫落酸效應元件相互作用來調控COR，增強植物的耐寒能力(Kim, 2001)；從牽牛花中得到的鋅指蛋白ZPT2-3，其在植物體內的過表達可以增強耐寒能力(Sugano, 2003)。在人類疾病方面也有相關的研究報道，其對信號通路的下游基因表達有著明顯的調控作用，可以選擇性結合特異的靶結構，調控細胞的生長、增殖、分化和凋亡等(雷陳, 2010)。但在水生生物中的研究卻極少，本文研究結果顯示，高溫脅迫條件下，C2H2鋅指蛋白家族Unigene數目遠遠高于其他轉錄因子，其中，差異表達基因數為108個，表明C2H2鋅指蛋白家族的部分基因在大菱鲆熱脅迫條件下發生表達水平的變化，哪些基因與熱應激相關？這些基因是如何參與脅迫應答信號轉導過程的？目前，在海水魚類未見報道，本課題組將在今后的研究中繼續深入開展。

本研究首次利用Illumina Hiseq高通量測序技術對大菱鲆腎臟組織在5個不同溫度脅迫條件下的cDNA文庫進行測序，建立了大菱鲆熱應激腎臟轉錄組數據庫，相關數據更加完整、系統，為今后開展海水魚類熱應激脅迫分子調控機制提供數據支撐，也為耐高溫選育工作提供更多新的功能基因和分子標記。

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Transcriptome Study of Kidney of Turbot under High-Temperature Stress

YANG Kai1,2,3, HUANG Zhihui1,3, MA Aijun1,3①, LIU Xiaofei1,3, YANG Shuangshuang1,3

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Shandong Key Laboratory of Marine Fisheries Biotechnology and Genetic Breeding; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Inordertoexplorethemolecularmechanism of high-temperature tolerance in turbot,L., and to screen heat tolerance related genes, the IlluminaHiSeq-2500 platform was used to sequence the transcriptome of five turbot kidneys from five different heat treatments, through bioinformatics analysis, including GO (gene function annotation), SSR (simple repeat sequence) analysis, etc. The main results obtained were as follows: the total number of Unigenes obtained by assembly was 68525, the length range was 201~23456 bp, the average length was 1124 bp, and the length of N50 was 2316 bp. Sequence alignment and function annotation of Unigenes was conducted in Nr, Swissprot, KEGG, KOG, and GO databases. A total of 25,498 clusters were obtained, of which the Nr database noted the most Unigenes; and according to GO function classification, had three kinds of cell components, molecular functions, and biological processes, including 56 functional groups. A large number of Unigenes were related to cell processes, metabolic processes, catalytic activities, biological regulation, and stress response. Further, Unigenes were classified into 218 metabolic pathways and five KEGG pathways: metabolic pathway, genetic information processing, cellular processes, environmental information, and biological systems. A total of 65 transcription factors were detected by transcription factor analysis, with the C2H2 Zn finger protein family having the highest number of genes. Through the analysis of gene expression profiles under different temperature stress, there were significant differences among different temperature groups, In the 20℃and 28℃groups, the difference was the largest; 4734 genes, of which 3386 were up-regulated and 1348 were down-regulated. In this study, we established a database of renal transcriptional groups in turbot under heat stress, which provides abundant data for the study of molecular mechanisms of heat stress in turbot.

Turbot; Kidney; Hyperthermia stress; Transcriptome; Bioinformatics analysis

S917.4

A

2095-9869(2020)01-0086-10

10.19663/j.issn2095-9869.20181211001

* 現代農業產業技術體系專項(CARS-47-G01)、青島海洋科學與技術試點國家實驗室“鰲山人才”培養計劃項目(2017ASTCP-OS04)、國家自然基金項目(41706168)、山東省良種工程(2016LZGC031)和中國水產科學研究院基本科研業務費(2016HY-JC0302)共同資助 [This work was supported by Modern Agricultural Industry Technology System (CARS-47-G01), Aoshan Talents Cultivation Program Supported by Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (2017ASTCP-OS04), National Natural Science Foundation of China (41706168), Good Seed Project of Shandong Province (2016LZGC031), and Chinese Academy of Fishery Sciences Basal Research Fund Under Contract (2016HY-JC0302)] 楊 凱, E-mail: 791590743@qq.com

馬愛軍，研究員, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

2018-12-11,

2019-01-03

http://www.yykxjz.cn/

楊凱, 黃智慧, 馬愛軍, 劉曉菲, 楊雙雙. 高溫脅迫條件下大菱鲆腎臟轉錄組研究. 漁業科學進展, 2020, 41(1): 86–95

Yang K, Huang ZH, Ma AJ, Liu XF, Yang SS. Transcriptome study of kidney of turbot under high-temperature stress. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 86–95

MA Aijun, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)