白頭翁皂苷B4對慢性腎功能衰竭大鼠腎組織的保護(hù)作用及其機(jī)制

郭向輝，鄭 慧， 吳 巍

(1．河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院急診內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 唐山 063000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710038)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是由各種原因引起的慢性進(jìn)行性腎實(shí)質(zhì)損害，導(dǎo)致腎臟明顯萎縮，無法維持其基本功能，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。白頭翁[Pulsatillachinensis(Bge.)Regel]是一種臨床常用中藥，具有清熱解毒和止痰化濕的功效，常用于濕熱痢疾等濕熱證。白頭翁中分離得到的多種皂苷類化合物，具有抗炎和抗腫瘤等作用[2-4]。白頭翁皂苷B4為白頭翁皂苷中主要單體成分之一，國內(nèi)外對于白頭翁皂苷B4的藥理研究報(bào)道較少。研究[5]結(jié)果顯示：白頭翁皂苷B4對內(nèi)毒素(LPS)所致人胚腎細(xì)胞HEK293 損傷具有保護(hù)作用，但目前白頭翁皂苷B4對CRF的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。研究[6]顯示：氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞中線粒體脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的過氧化，進(jìn)一步激活相關(guān)的凋亡蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激主要通過B淋巴細(xì)胞瘤2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)家族、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑等觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號。本研究采用腺嘌呤灌胃法建立CRF大鼠模型，并給予白頭翁皂苷B4進(jìn)行干預(yù)，通過檢測大鼠血清中血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平，觀察腎組織中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)變化及磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/ 蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路的激活及相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)表達(dá)水平，探討白頭翁皂苷B4對CRF大鼠腎組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑及儀器 75只雄性SD大鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。白頭翁皂苷B4 (C59H96O26，相對分子質(zhì)量為1 221.39)，購自美國Sigma公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自廣州菲博生物科技有限公司，白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6 )和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA 試劑盒及Caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體均購自英國Abcam公司。7100 型全自動生化分析儀購自日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組、造模及給藥 75只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組，每組15只。使用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的腺嘌呤溶液進(jìn)行等體積灌胃21 d復(fù)制CRF模型。造模后，從內(nèi)眥靜脈取血，檢測大鼠血清Scr和BUN水平，判斷CRF大鼠模型是否成功[7]。大鼠造模成功后，陽性對照組大鼠灌胃給予0.5 mg·kg-1地塞米松，低劑量組和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠灌胃給予劑量為1和2 mg·kg-1的白頭翁皂苷B4，連續(xù)干預(yù)28 d。對照組和模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水。

1.3 大鼠血清Scr和BUN水平檢測 各組大鼠在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)用10%水合氯醛、0.003 mL·g-1經(jīng)腹腔注射麻醉，從內(nèi)眥靜脈叢各取血5 mL。靜置1 h后，離心并分離血清，采用7100 型全自動生化分析儀檢測大鼠血清中Scr和BUN水平。

1.4 HE染色觀察大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn) 將實(shí)驗(yàn)大鼠處死，迅速取一部分腎組織，4%甲醛固定后用石蠟包埋，切片，HE染色，在光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1.5 大鼠腎組織中SOD活性和MDA水平檢測 取各組大鼠腎臟組織稱質(zhì)量，按體積(V)︰質(zhì)量(W)= 9︰1的比例加入生理鹽水，剪碎組織，冰上稀釋勻漿，離心并分離上清，采用SOD和MDA試劑盒按照說明書檢測SOD活性和MDA水平。

1.6 ELISA法檢測大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平 取1.5中的組織上清，依照ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7 Western blotting法檢測大鼠腎組織中p-Akt和細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平 收集各組大鼠待測腎臟組織，用RIPA進(jìn)行裂解提取總蛋白，然后SDS-PAGE凝膠電泳分離各組蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的BSA 封閉2 h后更換為相應(yīng)的一抗(Caspase-3、p-Akt、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體)，4℃過夜孵育。第2天加入二抗室溫孵育1 h，最后加入顯色液于凝膠成像儀進(jìn)行曝影。使用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。目的蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 對照組大鼠生理狀態(tài)良好，精神狀態(tài)佳，飲食飲水正常，毛色光滑順澤，因突發(fā)人為意外造成1只大鼠死亡，其余14只全部存活良好。模型組大鼠腺嘌呤灌胃3～7 d后，精神不振，反應(yīng)遲鈍，多飲少食，尿量增多；10 d后大鼠皮毛稀疏、無光澤，體質(zhì)量明顯下降，并逐漸出現(xiàn)死亡，共死亡5只，15 d后狀態(tài)略有恢復(fù)。陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠藥物干預(yù)結(jié)束后分別存活13、12和12只，大鼠精神狀態(tài)、飲食狀況、毛色和尿量等生存狀態(tài)特征較模型組大鼠均有不同程度的改善，陽性對照組和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠改善情況優(yōu)于低劑量白頭翁皂苷B4組。

2.2 各組大鼠血清中Scr和BUN水平 與對照組比較，模型組大鼠血清中Scr和BUN水平明顯升高(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠血清中Scr和BUN水平均明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平Tab.1 Levels of serum Scr and BUN of rats in various groups

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with model group.

2.3 各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn) 對照組大鼠腎小球和腎小管無病理改變，管腔未見結(jié)晶物沉積；模型組大鼠正常腎小體數(shù)量減少，腎小球充血，部分腎小球輕度萎縮，個(gè)別腎小球管腔可見棕黑色結(jié)晶物；陽性對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小接近正常，血管球未見明顯萎縮，腎小管結(jié)構(gòu)正常；低劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎小球充血，部分腎小管被增生的纖維組織取代，少數(shù)腎小球輕度萎縮；高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎小球部分充血，部分腎小球輕度萎縮，大部分腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)均基本正常。見圖1(插頁六)。

A:Control group; B:Model group; C, D: Low and high doses of anemoside B4 groups; E: Positive control group.
圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)(HE,×400)
Fig.1 Pathomorphology of kidney tissue of rats in various groups (HE,×400)

2.4 各組大鼠腎組織中SOD活性和MDA水平 與對照組比較，模型組大鼠腎組織中SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎組織中SOD活性明顯升高(P<0.01)，MDA水平明顯降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠腎組織中SOD活性和MDA水平Tab.2 Activities of SOD and levels of MDA in kidney tissue of rats in various groups

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with model group.

2.5 各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平 與對照組比較，模型組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表3。

表3 各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.3 Levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in kidney tissue of rats in various groups

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with model group.

2.6 各組大鼠腎組織中Bax、Caspase-3、Bcl-2和p-Akt蛋白表達(dá)水平 對照組大鼠腎組織中Bax、Caspase-3、Bcl-2和p-Akt蛋白表達(dá)水平分別為0.08±0.02、0.07±0.04、0.42±0.04和0.47±0.06，與對照組比較，模型組大鼠腎組織中Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平(0.51±0.07和0.49±0.06)明顯升高(P<0.01)，Bcl-2和p-Akt蛋白表達(dá)水平(0.090±0.001，0.080±0.001)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎組織中Bax蛋白表達(dá)水平(0.17±0.02、0.35±0.02及0.19±0.01)和Caspase-3蛋白表達(dá)水平(0.22±0.01、0.28±0.01及0.25±0.01)明顯降低(P<0.01)，p-Akt蛋白表達(dá)水平(0.33±0.01、0.18±0.01及0.36±0.03)和Bcl-2蛋白表達(dá)水平(0.30±0.01、0.19±0.01及0.28±0.02)明顯升高(P<0.01)。見圖2。

3 討 論

CRF是由原發(fā)性或繼發(fā)性慢性腎病引起的進(jìn)行性腎損傷進(jìn)而引發(fā)的的臨床綜合征，會出現(xiàn)一系列癥狀和代謝紊亂，是各種慢性腎病發(fā)展的最終階段，其發(fā)生與氧化應(yīng)激、炎癥狀態(tài)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制有關(guān)[8]。

Scr和BUN水平是反映腎功能的重要生化指標(biāo)。本研究結(jié)果表明：白頭翁皂苷B4能下調(diào)CRF模型大鼠Scr和BUN水平，改善CRF大鼠的腎功能。

Lane 1:Control group; Lane 2:Model group; Lane 3: Low dose of anemoside B4 group; Lane 4: High dose of anemoside B4 group;Lane 5: Positive control group.
圖2 Western blotting法檢測各組大鼠腎組織中p-Akt、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.2 Electrophoregram of expressions of p-Akt,Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins in kidney tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

由于初始應(yīng)激的存在，自由基清除系統(tǒng)的損害和體內(nèi)活性氧(ROS)的增加，CRF患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)[9]。臨床研究[10]顯示：氧化應(yīng)激可加重CRF患者的腎功能衰竭。因此，慢性腎病患者接受抗氧化藥物治療，清除或滅活ROS可以減少或預(yù)防氧化應(yīng)激，從而減少或抑制由氧化應(yīng)激引起的腎損傷[11]。SOD是機(jī)體中具有重要抗氧化作用的酶，其水平直接反映機(jī)體清除活性氧簇的能力；MDA是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其水平高低與機(jī)體內(nèi)自由基水平有關(guān)聯(lián)，主要反映機(jī)體受自由基損傷的程度[12-13]。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠腎組織中SOD活性明顯降低，MDA水平明顯增加，表明大鼠腎臟清除氧自由基的能力在腎功能衰竭后降低，并且不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物增加，細(xì)胞損傷增加；白頭翁皂苷B4治療后，大鼠腎組織中SOD活性升高， MDA水平降低，白頭翁皂苷B4發(fā)揮抗氧化作用，能夠抑制CRF的進(jìn)一步發(fā)展。

CRF的原發(fā)病多見于慢性腎小球腎炎，慢性腎小球腎炎的發(fā)病因素主要是免疫介導(dǎo)的炎癥損害。在眾多炎癥因子中，IL-1β、IL-6 及TNF-α最為重要，可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的分泌，激活凝血系統(tǒng)，抑制纖維蛋白溶解系統(tǒng)，增加中性粒細(xì)胞溶酶體酶的釋放和炎性滲出以及氧自由基的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。隨著CRF的進(jìn)展，血清TNF-α和IL-6等炎癥生物學(xué)指標(biāo)明顯增加，因此即使未并發(fā)外源性感染，CRF本身也會引起機(jī)體炎癥[16-17]。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均有不同程度降低，表明白頭翁皂苷B4與地塞米松均具有明顯的抗炎作用，從而起到保護(hù)腎臟組織損傷的作用，且其效果呈劑量依賴性。

研究[18-19]顯示：氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡，機(jī)體過氧化可以通過多種途徑包括內(nèi)源性或外源性通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且一些構(gòu)成因素可能通過協(xié)同和重疊作用來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，PI3K/Akt 是生物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典通路之一，PI3K通過調(diào)控激活其下游靶點(diǎn)Akt磷酸化，直接抑制Akt下游信號分子包括Bax、Bad、Bcl-2和Caspase-9等[20-21]。本研究中Western blotting檢測結(jié)果顯示：與模型組比較，陽性對照組、低和高劑量白頭翁皂苷B4組大鼠腎組織中Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明地塞米松和白頭翁皂苷B4均可通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平，從而減少腎臟細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)CRF大鼠腎臟組織的作用；白頭翁皂苷B4還可以通過激活PI3K/Akt通路來減少腎臟細(xì)胞凋亡，通路激活與Akt磷酸化有關(guān)，提示Akt是白頭翁皂苷B4保護(hù)腎臟的潛在靶點(diǎn)之一。

綜上所述，白頭翁皂苷B4可通過抗氧化應(yīng)激減輕CRF大鼠的腎功能衰竭，通過減少炎癥因子釋放起到抗炎作用從而保護(hù)腎臟的損傷，也能通過激活PI3K通路減少腎臟細(xì)胞凋亡，從而多方位地對腺嘌呤誘導(dǎo)的CRF模型大鼠起保護(hù)作用。但白頭翁皂苷B4對CRF大鼠腎功能的保護(hù)作用機(jī)制還很復(fù)雜，尚有待進(jìn)一步的研究。