建立天舒片指紋圖譜分析方法

劉琴，梁瑩瑩，陳美玲

（江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222047）

0 引言

指紋圖譜能較全面反映中藥制劑成分信息。有效保證中藥的安全性、有效性和穩定性。天舒片原有質量標準僅從單一化學指標的變化情況來控制制劑，并不能全面控制產品質量。天麻、川芎為該藥的主要有效成分，所以為較全面的反映天舒片的內在質量，實現對該產品質量的精確全面的控制。

1 實驗部分

1.1 材料。高效液相色譜儀（Agilent 1200），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（柱長為250 mm，柱內徑為4.6 mm，粒徑為5μm），電子天平（Mettler 公司），數顯恒溫水浴鍋，水為自制超純水，甲醇為分析純和色譜純，磷酸為分析純。天舒片由江蘇康緣藥業股份有限公司提供（批號分別為161001、161002、161003、161004、161005、161006、161101、161102、161103、161104）；天麻、川芎購自河南省皖西制藥股份有限公司；阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110773-201614）。

1.2 方法與結果

1.2.1 色譜條件[1]：色譜柱：以C18為填充劑（柱長為250 mm，柱內徑為4.6 mm，粒徑為5μm），紫外檢測器，檢測波長為276 nm。柱溫為30℃。流動相A為甲醇，流動相B為0.1%磷酸溶液，按下表中的方法進行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min。如表1。

表1 色譜條件

1.2.2 參照物溶液的制備：精密稱取阿魏酸對照品，用50%甲醇溶液溶解并制成每1 mL含20μg的溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備：取本品研細，精密稱取約1g，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理（功率：250W，頻率40 kHz）30分鐘，取出，搖勻，濾過，取續濾液，即得[2]。

1.2.4 方法學驗證

（1）精密度試驗：取天舒片（批號為：161003），按1.2.3供試品溶液的制備方法制備，連續進樣6次，記錄色譜圖，以阿魏酸峰為S峰，計算供試品中各共有峰與S峰的相對保留時間的相對標準偏差值，結果小于0.9%，表明精密度良好。

（2）重復性試驗：取天舒片（批號為：161003），按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，分別進樣分析，計算供試品中各共有峰與S峰的相對保留時間的相對標準偏差值，結果小于0.9%，表明該方法重復性良好。

（3）穩定性試驗：取天舒片供試品溶液，分別于0小時，2小時，4小時，8小時，12小時，24小時進樣分析，以阿魏酸峰為S峰，計算各共有峰與S峰的相對保留時間的相對標準偏差，結果小于1.5%，表明該溶液在24小時內穩定，樣品溶液的穩定性較好。

1.2.5 指紋圖譜的建立

（1）共有峰的確定：取天舒片樣品10批，分別按1.2.3項下制備供試品溶液，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄60分鐘色譜圖。采用相對保留時間標定共有峰，以色譜圖中阿魏酸峰為S峰，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中S峰的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，計算10批樣品指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間。其中7個色譜峰為10批樣品所共有，故確定他們為共有峰[3-5]。

（2）指紋圖譜相似度評價：采用最新《中藥色譜指紋圖譜相似度評價》軟件進行相似度計算。設置批號161003的樣品圖譜為參照圖譜，多點校正后自動匹配，生成標準指紋圖譜見圖1。結果10批天舒片（161001、161002、161003、

161004、161005、161006、161101、161102、161103、161104）的相似度分別為0.973、0.979、0.970、0.989、0.996、0.979、0.990、0.992、0.953、0.978。表明建立的指紋圖譜的方法穩定、重復性好。

圖1 標準指紋圖譜

2 討論

2.1 檢測波長的確定。取阿魏酸對照品在200-800 nm進行紫外全波長掃描。結果：在276 nm下有最大吸收。分別在271 nm、276 nm、281 nm下進行分析。結論：在276 nm波長下進行測定，得到的共有峰個數最多。最終選擇檢測波長為276 nm。

2.2 色譜柱考察。取Phenomenex和Kromasil兩種不同品牌的C18柱進行色譜分離試驗。結論：兩者色譜峰信息相同，分離效果相當，但是Phenomenex色譜柱購買困難，最終選擇了Kromasil色譜柱[6-8]。

3 結論

色譜條件的分析，根據指紋圖譜的建立標準對樣品進行分析表明，60分鐘前，樣品的主要成分得到良好的分離。符合的相關要求。

本實驗照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》采用HPLC法對天舒片中主要成分及色譜條件進行研究，從相對保留時間可以看出，10批樣品色譜圖中各個色譜峰保留時間匹配較好，確定了7個共有峰。方法學驗證表明其精密度、重復性、穩定性均良好，證明所建立的指紋圖譜方法可行性高[9]。并采用指紋圖譜相似度軟件對天舒片指紋圖譜進行了相似度計算，結果10批不同批次的天舒片的指紋圖譜均具有較高的相似度，表明各批次成分無明顯差異，為天舒片的質量評價和質量標準提高提供了重要依據。