質譜技術在出生缺陷防控中的應用

李增明

（江西省婦幼保健院，南昌 330006）

出生缺陷是指出生以前就已發生的身體功能上、結構上，或代謝的異常，出生缺陷是導致死胎、流產、嬰幼兒死亡和先天性殘障的主要原因之一，預防和減少出生缺陷，是提高出生人口素質、實施健康中國行動和奪取脫貧攻堅全面勝利的內在要求。為了降低出生缺陷發生率，WHO 提出了出生缺陷的三級預防策略[1,2]。出生缺陷發生的原因主要包括遺傳因素、環境因素以及遺傳環境兩因素相互作用，建立高靈敏度、高特異性、高通量和穩定性好的出生缺陷風險評估預測、篩查、診斷和鑒別診斷及成因因素分析檢測方法，對于出生缺陷的防控具有重要意義[3,4]，質譜分析的精準定性定量特性使得其可為出生缺陷的篩查、診斷和鑒別診斷和成因分析提供科學依據，因此質譜技術在出生缺陷防控中發揮著重要作用。現對質譜技術在出生缺陷防控中的應用進展進行綜述，以期為質譜技術在出生缺陷風險預測、篩查、檢測和診斷中的進一步應用提供參考。

1 質譜技術概述

質譜是眾多分析技術中同時具備了靈敏度高、特異性好、響應速度快的普適性分析檢測方法，在諸多分析測試領域均有非常廣泛的應用。目前已有13 個諾貝爾獎授予了與質譜技術的誕生和發展以及有關應用方面的研究。2002 年，美國芬恩教授和日本田中耕一教授發明了生物大分子質譜分析法，獲得諾貝爾化學獎[5]。

質譜技術由于其在靈敏度和特異性上的突出優勢，適合于復雜臨床生物樣本的分析檢測，該技術在臨床檢測和診斷領域的發展尤為迅猛。目前質譜技術除了已成為臨床小分子化合物的主要質控參考方法外，在臨床內分泌、治療藥物監測、新型生物標志物發現分析等臨床檢測領域應用越來越廣泛，可為疾病的診斷提供準確可靠的臨床依據，在臨床檢測診斷領域發揮愈來愈重要的作用。質譜分析的精準定性定量特性在臨床分析特別是在精準醫療方面提供了快速可靠的解決方案。目前質譜技術的臨床應用主要是對人體的體液 （如血液、尿液、唾液等）和人體組織切片的分析，揭示疾病的相關信息，對生理病理研究和臨床診斷具有重要意義。質譜技術在出生缺陷風險預測、篩查、檢測和診斷中的應用具有如下優勢：質譜技術具有突出的特異性；靈敏度高也是質譜技術的另外一個突出優勢；質譜技術具有多通道檢測能力，可以同時檢測多種化合物，因此通量較高，所需樣本量少。

2 質譜技術在出生缺陷一級預防中的應用

出生缺陷的一級預防手段主要是通過婚前、孕前醫學檢查和胚胎植入前遺傳學診斷 （Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD）實現。通過婚前、孕前篩查和PGD 防治出生缺陷，國內外都有成效顯著的先例。針對遺傳相關的出生缺陷，以單細胞高通量檢測方法為核心的PGD 技術，相關技術進一步臨床應用轉化，構建新型、主動、精準且高效的遺傳性出生缺陷孕前發現診斷、胚胎植入前即可阻斷的出生缺陷防控新模式，創建有特色優生和防控關口前移的新模式。PGD 技術是對胚胎或極體或卵子行卵裂球/滋養層細胞進行活檢，開展染色體和/或基因組學篩查檢測，檢測結果可提示胚胎攜帶的遺傳變異情況，進而疾病的精準分類和精準診斷，選擇未攜帶基因和染色體異常的胚胎植入子宮進而出生健康新生兒的方法。PGD 技術可以從根源上解決生育遺傳性出生缺陷問題，其通過只移植健康胚胎，進而可以進行一級預防遺傳相關出生缺陷新生兒的出生，可以避免產前診斷有創性操作導致的感染、出血以及流產等并發癥發生，避免孕婦懷遺傳病胎兒時經受的身心損害，并且徹底阻斷了致病基因遺傳，真正實現了優生優育，是目前臨床精準醫學應用的典范[6]。

在婚前孕前醫學檢查和PGD 中，脫氧核糖核酸分析對于遺傳性出生缺陷的風險預警、篩查和檢測非常重要，因此,建立和發展靈敏、快速、高效和精準的DNA 各種性質的分析方法具有重要意義。在20 世紀 80 年代末，Tanaka 等提出基體輔助激光解吸電離技術，并與飛行時間質譜相結合，產生了“軟”電離的基體輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)，目前，MALDI-TOF-MS已被應用于脊髓性肌肉萎縮癥基因檢測、地中海貧血基因檢測、G6PD 基因突變檢測和葉酸代謝相關基因檢測等[7,8]。傳統的DNA 分析方法主要有熒光定量PCR、數值化PCR 和毛細管測序法，其缺點是通量較低單次分析檢測的位點少，新興的基因芯片法、二代測序和單分子測序用于DNA 分析優點是高通量且獲得的信息量大，其缺點是成本高、周期長、操作復雜、解讀難，而飛行時間質譜用于DNA 分析具有中通量且可以多基因多位點分析，具有準確、快速、經濟的優點。

神經管畸形 ( Neural tube defects，NTDs) 是指神經管具有缺陷導致的嚴重先天性畸形，補充合適劑量的葉酸是降低NTDs 發病率的重要預防措施。然而，葉酸過量也存在一定的副反應：過量劑量的葉酸會掩蓋進而加重維生素B12缺乏引發的相關癥狀，過量劑量的葉酸不適合預防NTDs，還可能會引發智力及發育障礙等。再者也不是所有的NTDs 通過補充葉酸都可以進行預防。因此葉酸及其代謝產物的分析檢測對于NTDs 風險預測和評估及指導精準補充葉酸非常重要。黃敏等[9]建立了基于液相色譜質譜方法的葉酸及葉酸的代謝產物5-甲酰基四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、同型半胱氨酸、組氨酸和絲氨酸的檢測方法并用于NTDs 的發病風險評估和預測具有很好的陽性預測值。

早期生命的各種影響因素是生命體出現疾病的最早影響因素，這種作用甚至可以決定個體未來的健康情況。Baker 等發表 “成人疾病胎源學說”，該學說認為宮內受到有害因素暴露或營養不良，會導致胎兒的組織器官在功能和結構上發生程序性或永久性改變，這些變化增加了出生缺陷的風險。目前我國環境污染形勢嚴峻，孕前進行環境有害物質暴露水平的檢測和評估對預防出生缺陷有重要意義。要準確真實評估環境有害物質暴露水平和劑量，首先得建立高靈敏度、高特異性、高通量且穩定性好的分析檢測方法。質譜技術由于其在靈敏度和特異性上的突出優勢，適合于復雜臨床生物樣本的分析檢測，越來越受到重視。Yang BC 等[10]發展了固相基底電噴霧電離直接質譜技術，在無需樣品預處理的情況下，以醫用棉簽取樣后直接耦合在納升電噴霧電離質譜儀上，實現了尼古丁和可替寧直接快速定性定量分析，1min 內可以完成一個樣本的檢測，大大提高了分析速度，節約時間的同時也節約了大量溶劑成本。經濟飛速發展同時帶來了城市機動車輛的快速增長，冬季燃煤取暖和機動車尾氣排放造成的環境污染問題日益突出，多環芳烴化合物就是不可忽視的重點污染物之一。來自世界范圍的多項研究發現人體尿液中多環芳烴代謝物檢出率大于90%，提示人類普遍暴露于多環芳烴。近年來評估人體接觸多環芳烴的暴露情況已成為新的研究熱點，目前研究表明多環芳烴具有致癌、致突變和發育毒性，而孕婦作為易感人群，孕前及婚前進行多環芳烴暴露水平的評估對于指導生育具有重要意義，Yang BC 等[11]發展了固相微萃取-玻璃毛細管納升電噴霧電離質譜技術，在無需樣品預處理的情況下，實現了人尿液中多環芳烴六種代謝物的快速定性定量分析，1 分鐘內可以完成一個樣本的檢測，大大提高了分析速度。

3 質譜技術在出生缺陷二級預防中的應用

產前篩查和產前診斷是預防出生缺陷的第二道防線。采用 PCR 技術、Sanger 測序技術、SNP array 和NGS 對羊水細胞或絨毛膜組織基因檢測在遺傳代謝缺陷病的產前診斷中發揮著重要作用，基因檢測的優點是準確，可明確是患者、攜帶者或無攜帶，缺點是基因型和表型相關性問題：單個遺傳基因座的不同突變可以不同的疾病，并且不同的個體中相同的突變可以引起不同嚴重程度的疾病。基因組學結果反映的是什么是可以發生的，轉錄組學結果反映的是什么是即將發生的，蛋白質組學結果反映的是什么是正在發生的，只有代謝組學結果才真正反映什么是已發生的，因此采用質譜方法檢測羊水中代謝產物水平的變化有助于一些遺傳代謝缺陷病的明確產前診斷，且羊水代謝產物檢測分析速度更快。如在有機酸血癥胎兒的產前診斷中，健康孕婦羊水里酰基肉堿水平和有機酸代謝產物濃度都很低，但懷有有機酸血癥胎兒的孕婦羊水中這些酰基肉堿和有機酸代謝產物會顯著增高，結合基因檢測的結果和羊水氣相色譜質譜代謝產物測定結果,有助于提高產前診斷的準確性。并且在不同孕期孕婦羊水中有機酸和酰基肉堿水平并無明顯差異。韓鳳等[12]探討了氣相色譜質譜聯用技術及液相色譜質譜測定羊水中的有機酸即酰基肉堿水平用于丙酸血癥胎兒產前診斷的應用價值。收集40 例進行產前診斷且生育過丙酸血癥患兒的孕婦作為丙酸血癥母親組。從同期進行常規產前診斷孕婦中隨機選取40例作為對照組。兩組孕婦都是在妊娠16～20 周通過羊膜腔穿刺術抽取得到羊水，然后通過液相色譜質譜測定羊水丙酰肉堿和乙酰肉堿濃度,通過氣相色譜質譜測定羊水中甲基枸櫞酸和3-羥基丙酸濃度,羊水細胞進行基因檢測。結果丙酸血癥母親組孕婦羊水丙酰肉堿和甲基枸櫞酸水平均高于對照組,可利用串聯質譜及氣相色譜質譜技術檢測羊水中的丙酰肉堿、甲基枸櫞酸水平,對先證者為丙酸血癥的孕婦進行產前診斷。

地中海貧血是世界上最常見的單基因遺傳病之一，通過二級預防產前診斷是地中海貧血防控的重要措施之一，母血漿胎兒游離核酸的發現為地貧的無創性產前診斷提供了新的途徑。近些年來,飛行時間質譜分析已應用于針對地貧遺傳缺陷(特別是β 地貧點突變)的母血漿胎兒游離DNA 檢測[13]。

4 質譜技術在出生缺陷三級預防中的應用

新生兒篩查是預防出生缺陷的最后一道防線。1990 年時來自美國杜克大學的陳垣崇教授團隊成員Millington 博士率先提出采用串聯質譜技術開展新生兒遺傳代謝性疾病的篩查[14]。1995 年時Rashed 等利用電噴霧電離質譜技術進行新生兒代謝性疾病的篩查，篩查出丙酸血癥、短鏈及中鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥、甲基丙二酸血癥等多種遺傳代謝病[15]。電噴霧電離質譜技術是一種軟電離技術，該技術與自動連續進樣器聯用，應用自動進樣器提升了分析的速度和準確度，使得分析通量大大提升，為大規模進行新生兒遺傳代謝病篩查奠定了有利條件，從此各新生兒疾病篩查實驗室開始使用串聯質譜技術進行新生兒遺傳代謝病篩查。

采用串聯質譜技術進行新生兒遺傳代謝病篩查，其在2-3 分鐘內對每個標本可同時測定幾十種小分子代謝物，測定物質包括氨基酸及脂肪酸線粒體氧化代謝紊亂和有機酸障礙在內的40 余種遺傳代謝性疾病，使得新生兒遺傳代謝性疾病的篩查從“一次實驗只能篩查一種疾病”向“一次實驗可篩查多種疾病” 轉變，質技術具有靈敏度高、、分析速度快且分析通量高的優點，質譜技術應用于新生兒遺傳代謝病篩查不僅增加了篩查疾病的病種，還大大提高了篩查的速率及篩查的準確性和特異性，進而使得新生兒遺傳代謝病的篩查進入到新紀元。

串聯質譜技術通過聯合二級檢驗指標能夠有效地改善傳統篩查性能。比如，先天性腎上腺皮質增生癥常規篩查的生物標志物是17α-羥孕酮，但假陽性率很高。Minutti 等[16]發展了基于 液相色譜質譜聯用技術同時測定血斑中雄烯二酮、17α-羥孕酮等類固醇類物質，這種二級篩查能夠識別常規篩查中的假陽性結果。11β-羥化酶缺陷癥引發的先天性腎上腺皮質增生癥較為罕見，其不是新生兒遺傳代謝病篩查檢測的主要疾病。然而標準的免疫實驗檢驗中，患兒的17α-羥孕酮水平會輕度增加。Peter 等[17]發展了基于 液相色譜質譜聯用技術對通過免疫測定法發現的17α-羥孕酮濃度增高的患兒的血片進行二級篩查檢測，結果發現這種血片中雄烯二酮和11-脫氧皮質醇水平升高，而皮質醇濃度降低，結合家族病史即可診斷為11β-羥化酶缺陷癥。通過濾紙干血斑檢測總高胱氨酸水平已成為現實，就是在出生后3 天內采濾紙干血斑，這種檢測方法的敏感性還可達到100%，因此可以發展為新生兒高胱氨酸尿癥檢測首選方法。再而，串聯質譜遺傳代謝病的陽性篩查結果不僅僅是一種代謝物的水平的變化，還可以多指標提示，這大大提高了遺傳代謝病篩查的特異性和敏感性，使得篩查檢出率比臨床診斷更高。

采用氣相色譜-質譜聯用技術檢測尿液中有機酸水平對于有機酸血癥等遺傳代謝缺陷病的篩查、診斷和鑒別診斷具有重要作用，與串聯質譜檢測濾紙干血斑中的氨基酸肉堿水平相比，氣相色譜-質譜聯用技術檢測尿液中有機酸水平操作復查，通量較低，限制了其大規模開展，下一步有必要研發簡便快速高通量準確的尿液中有機酸水平質譜分析檢測方法。

溶酶體貯積癥由于基因突變引發轉運蛋白或溶酶體酶缺乏進而造成底物在溶酶體內聚集而引發的一類遺傳代謝疾病，多數為常染色體隱性遺傳，也有部分為X 染色體連鎖遺傳。溶酶體貯積癥會損傷全身多種器官，首先是中樞神經系統，溶酶體貯積癥的臨床癥狀具有進行性發展特點，如果沒有及時治療或許引發患者死亡或終身殘疾。我國大陸目前還沒有進行新生兒溶酶體貯積癥的群體篩查，造成許多溶酶體貯積癥患兒無法早發現早治療，因此開展新生兒溶酶體貯積癥群體篩查有重要意義。溶酶體貯積癥的群體篩查方法主要有：質譜技術、多免疫定量法和熒光法。熒光法由于非特異性其不能同時測定多種酶的活性因此假陽性高，多免疫定量法目前還沒批準試劑盒，而質譜技術具有準確度高、靈敏度好且一次檢測篩查發現多種疾病，因而在溶酶體貯積癥群體篩查中有優勢。萬智慧等[18]利用串聯質譜技術檢測6 種溶酶體貯積癥：戈謝病、尼曼匹克病A/B、克拉伯病、黏多糖貯積癥I 型、法布里病和龐貝病的篩查指標，評估質譜方法用于新生兒6 種溶酶體貯積癥篩查的可行性。結果表明質譜方法適用于6 種溶酶體貯積癥的新生兒篩查，也可用于相關6 種溶酶體貯積癥患者治療后的酶活監測，為串聯質譜法篩查溶酶體貯積癥奠定了基礎。

我國現在殘疾人8296 萬，其中聽力障礙人群高達2780 萬。遺傳因素是致聾的主要因素之一，新生兒物理聽力篩查聯合耳聾基因篩查是防聾控聾的最佳策略。付華鈺等[19]比較了芯片法和飛行時間質譜法在非綜合征性耳聾基因篩查中的應用，發現兩種方法檢測結果并無顯著差異，飛行時間質譜技術的檢測位點多且檢出率高，這在一定程度可減少漏篩率，在大規模人群耳聾基因篩查中有其優勢，但飛行質譜方法方法所需的儀器設備成本較高，對檢測人員的專業水平要求較高。

5 結語

質譜技術在出生缺陷三級預防中均有所應用，但應用最為廣泛的是串聯質譜新生兒遺傳代謝病篩查，其優勢在于操作方便、高通量、篩查病種多。質譜技術優勢是靈敏度高、特異性好、可多通道檢測同時檢測多種化合物。質譜技術出生缺陷的進一步應用存在一些瓶頸，如影響結果可靠性和重現性的因素多；如基質效應、干擾、源內變構及方法標準化跟免疫法比較，質譜法自動化程度還是很低，需要樣品處理和色譜分離，手工操作難以避免，難以實現隨機插入同時也面臨法規上的瓶頸；如相關規范性文件和收費標準。