現代微生物分類鑒定技術在綠色環保化白酒釀造中的應用

隋 明,謝慧蓉,周 文,唐賢華

(1.四川工商職業技術學院 酒類與食品工程系,四川 都江堰 611830;2.四川大學 輕紡與食品學院,四川 成都 610065)

白酒是經過不同種屬微生物長時間發酵、陳釀分離形成的澄清透明的含乙醇產品。隨著科學和現代生物工程技術的發展,微生物技術已廣泛應用于白酒釀造。社會的不斷發展和人類健康意識的不斷增強,要求白酒釀造業實現綠色環保化,即生態釀酒,以實現經濟效益與生態效益的有效統一。這要求釀酒業應用現代微生物分類鑒定技術,尤其是對以PCR[1]和DNA[2]為主的微生物進行分類鑒定的技術,以確定白酒釀造不同階段的優勢菌群。

1 白酒的微生物分類鑒定技術概述

白酒作為一種常見且傳統的發酵產品,對發酵窖池的要求較高。白酒發酵時窖池中的微生物及其形成情況對酒體風格有重要影響[3]。五糧液、瀘州老窖等大型白酒企業都在窖池中培養微生物生存環境,以便微生物在窖池中發酵形成新的能量[4]。現代生物工程技術的研發為微生物的分類鑒定帶來了發展空間。在傳統微生物分類鑒定技術的基礎上[5],借鑒微生物代謝組學[6]和PCR、DGGE等微生物分析技術[7],可以為釀酒產業創建更好、更具體、更深刻的現代微生物分類鑒定技術,以彌補傳統微生物分類鑒定技術的不足。現代微生物分類鑒定技術能在釀酒發酵中實現微生物技術與其代謝規律的有效結合。

2 微生物分類鑒定技術在綠色環保化白酒釀造中的應用

綠色環保化白酒釀造即生態釀酒由沱牌集團的工程師提出。生態釀酒主要是指建立科學合理的微生物培養環境,用安全、高質量的方式實現釀酒行業經濟效益和社會效益的最大化;在整個白酒釀造過程中實現人與自然的和諧相處；對現有的釀酒資源給予低能耗處理,將綠色發展理念融入每一個生產環節,讓微生物的繁殖和生長建立在可持續發展的基礎之上。

2.1 傳統微生物分類鑒定技術

在新技術產生之前,白酒釀造過程中微生物的分類鑒定一般采取直接的方式,主要分為五個步驟。第一步是微生物樣品采集,包括酒曲、酒醪和制作過程中接觸的空氣微生物和水。第二步是對采集到的微生物進行計數,方法有三種[8]:一是通過顯微鏡觀察,這種方法要求先對樣品進行稀釋,且只能記錄微生物菌落的數量,無法對微生物的性質做出區分;二是活菌計數法,這種方法能顯示活菌的數量,但無法對死菌或休眠的菌體進行計算；三是最大可能計數法,通常用于測定具有特殊功能的菌群。第三步是釀酒微生物的培養和繁殖,目的是擴大活菌數量,增加釀酒過程中的菌落。第四步是微生物分離,采用的是梯度稀釋法,即對采集的微生物進行平板畫線,有效分離菌落。第五步是微生物鑒定,需要生化實驗輔助完成,即按相關說明和規范,對采集分離的微生物進行鑒定實驗,并檢驗實驗結果,確定微生物菌株。

2.2 基于PCR 的DNA指紋圖譜分類鑒定技術

近年來生物分類鑒定技術得到良好發展,PCR技術在釀酒業中被廣泛應用。用這種方式對微生物進行分類鑒定,不但快速、便捷、能耗低,而且可以驗證原料是否是轉基因產品[9]。使用數學模型如聚類分析法等對用氣質聯用、液相色譜測定的白酒風味數據進行歸類,能得到白酒樣品的風味特征,這種方法被稱為指紋圖譜法。展學孔等采用指紋圖譜法測定小曲白酒的風味強度特征等,發現原料的品種和產地對白酒品質有較大影響[10]。

2.2.1 PCR-DGGE 克隆分析技術

PCR-DGGE 克隆分析技術也叫變性梯度凝膠電泳技術,是聚合酶鏈式反應的后續變形方法。聚合酶鏈式反應的具體應用是對微生物體內存在特異性目的的片段進行擴張,使其改變原有的形態。使用變性梯度凝膠電泳技術，在聚丙烯酰胺凝膠中添加尿素和變性劑,同時控制凝膠比例,能使微生物的DNA排列發生梯度變化。在外部電壓相同的條件下,DNA的解鏈速度會發生改變,相應的電泳遷移率也會變化,可以從電泳上分離出需要的DNA片段,并用PCR-DGGE 克隆分析技術對其進行處理,以完成對微生物的分類鑒定。目前有學者將該項技術用于白酒釀造,如胡曉龍使用該項技術考察了濃香型白酒窖泥中梭菌的群落結構與窖泥質量之間的關系[11];江汶鈺等使用PCR-DGGE技術研究了豉香型白酒中的細菌群落[12]。

2.2.2 SSCP 技術

SSCP技術[13]建立在DNA特性基礎上,結合PCR-DGGE 克隆分析技術對微生物進行分類鑒定。這種方法更需要注意細節控制,主要目的是分析微生物的遺傳學特征。微生物菌落中有不同的基因序列,且序列長而完整,能夠提供豐富的分類信息。SSCP技術在釀酒過程中經常被用于鑒定霉菌分子微生物。

2.2.3 末端限制性片段長度分析技術

末端限制性片段長度分析技術是專門用于鑒定不同微生物群落的方法,也是一種指紋技術。微生物群落呈現的多樣性能被敏銳地檢測。將微生物設計成一對合適的引物,并做好明顯標記,經過PCR克隆擴展,加上酶切后特定的生長順序,將檢測到的標記與DNA片段進行對比,了解微生物群落的差異性,鑒定微生物群落的屬性。

2.2.4 擴增片段長度多態性分子標記技術

擴增片段長度多態性分子標記技術需要末端限制性片段長度分析技術做載體,并從中選擇聚合酶鏈式反應,將可以利用的酶作為研究對象進行基因順序的排列組合,培養不同的酶切片段。培養出的酶切片段可以用來和有共同黏性末段的人工接頭連接,形成技術模板,在其中加入引物,用克隆分析技術進行擴展,只有配對的微生物酶切片段才能被擴展。

2.3 磷脂脂肪酸法

磷脂脂肪酸法是從20世紀開始用于白酒研究的,用于幫助確定微生物定量問題，具有高效、快速等優點。不同種類的微生物菌類群落可以用不同的磷脂脂肪酸法進行研究。可以借助圖譜對微生物進行定量研究,標記設置的微生物群,確定群中微生物的性質和數量。磷脂脂肪酸法還可以用于鑒別活體的微生物群落。通常,我們認為微生物體內的細胞數量是一定的,在對微生物的種類進行鑒別時,這種方法具有輔助作用。曹宇等使用磷脂脂肪酸法研究了芝麻香型大曲中微生物群落的真菌、細菌含量及數量上的變化情況[14]。

2.4 Biolog微平板

Biolog 微平板是美國在20 世紀研發的一種技術,最初只能用于對純種的微生物進行分類鑒定,經過發展,現已能鑒定兩千多種菌類。Biolog 微平板能準確估計釀酒時微生物的生物群落代謝問題，具有靈活、分辨率高等優點。Biolog 微平板具有自動化和標準化的檢驗方式,能提升微生物分類鑒定效率。唐小麗等利用該技術分析芝麻香型白酒高溫大曲的微生物群落,發現發酵過程中的曲樣可以根據發酵時間分為四類[15]。

2.5 RNA/rDNA 序列分析

16SrRNA/rDNA 序列分析是現在標準的微生物鑒定方法,是通過對微生物的鑒定、擴展、測序相關記錄進行分析,按照國際標準將測序結果分成多個組合單元,最后將合成的數據提交到數據庫進行檢索,查詢相似度最高的序列,并設置發育樹,對微生物進行良好定位,便于查詢對比。18SrRNA/rDNA 序列分析主要用于奠定微生物群落在系統中的發育地位,因為無論是16SrDNA還是18SrDNA,都不會輕易受環境影響而改變自己的性質,因此，通過比較兩者的同源性可以確定它們在發育過程中的不同。

3 結語

白酒的釀造離不開微生物的作用。使用不同微生物分類鑒定技術既能發現微生物在釀造不同香型、不同窖齡白酒中的作用,也可以減少白酒釀造和檢測過程中的環境污染和原料浪費,更好地實現白酒綠色低碳產業化發展。在發展生態釀酒的過程中,可以通過微生物技術了解不同微生物的層次、性質和數量,掌握微生物的發展規律,尤其是曲子、窖泥中微生物群落演替的變化規律,為白酒口味的釀造奠定良好的基礎。