胚胎嵌合的發生機制及結局

戴旭，賈苗苗，柏海燕

(西安醫學院，西北婦女兒童醫院，西安 710003)

在輔助生殖臨床實踐中，胚胎嵌合(mosaic embryos)是指植入前胚胎包含兩種或兩種以上染色體核型不同細胞系的現象。按照細胞類型嵌合體胚胎分為二倍體-非整倍體細胞系嵌合和非整倍體-非整倍體細胞系嵌合，在無整倍體胚胎可移植的情況下，我們僅考慮移植二倍體-非整倍體細胞系嵌合胚胎。國際胚胎植入前遺傳學診斷協會(PGDIS)規定異常細胞占比20%～80%為嵌合體胚胎，>80%為非整倍體胚胎，<20%為整倍體胚胎[1]。

一、嵌合體胚胎的起源

嵌合體胚胎是胚胎有絲分裂過程中染色體異常分離所致[2]。卵母細胞異常、精子異常以及胚胎體外培養過程中的外源性干擾因素均可導致胚胎細胞染色體異常分離。精卵結合時卵母細胞提供早期胚胎發育所需的線粒體、mRNA以及適宜的細胞環境。精子僅頭部進入卵母細胞，并以其中心體為中心形成精星體，介導雌雄原核融合以及第一次卵裂。與非整倍體的發生率主要受母方年齡影響不同[3]，嵌合體胚胎的發生率與父方因素更加相關。有研究顯示不育男性的精星體通常會延遲形成，其介導的胚胎有絲分裂更易發生染色體異常分離[4]。Palmerola等[5]也證實，嵌合體胚胎的發生與精液參數相關，少弱精子癥患者嵌合體胚胎的發生率較其他精子活力差的病人更高。在有關嵌合體的研究中，各個生殖中心報道的嵌合體胚胎發生率不同，提示體外受精(IVF)過程中各個技術環節，如促排方案、卵泡抽吸方式、培養室環境及培養液等均可能與嵌合體胚胎發生率相關[3]。

二、嵌合體胚胎的形成機制

染色體異常分離導致嵌合體胚胎形成的主要機制有：染色體不分離、分裂后期延遲、內復制。這幾種機制本質都是細胞分裂過程中染色體異常分離的主要機制，并不是嵌合體胚胎形成所特有的機制。

1.染色體不分離(non-disjunction)：染色體不分離是指姐妹染色單體在有絲分裂中未分離，被紡錘絲牽引至同一子代細胞，在同一胚胎內形成三體-單體-二倍體三種細胞系嵌合。性染色體在胚胎發育的早期階段最常發生不分離[6]，而常染色體發生不分離后丟失的單體細胞有致死性，在胚胎發育過程中會被選擇性清除，最終會形成三體-二倍體細胞系嵌合胚胎。若不分離發生在胚胎細胞分化之前則會形成普遍性嵌合胚胎，其異常分離細胞分布于全身各個組織和器官，異常細胞占比在65%～70%之間[7]。若不分離發生在胚胎細胞分化之后特定的細胞譜系內則形成局限性嵌合。局限性嵌合的異常細胞僅分布于特定的某一個組織器官中，如限制性胎盤嵌合(confined placental mosaicism，CPM)，其異常細胞僅分布于胎盤組織，胎兒組織內無異常細胞。染色體不分離的分子機制還尚不清楚，有研究顯示聚合蛋白對維持正常的有絲分裂有重要作用，它保證了姐妹染色單體之間的凝聚力。Singh等[8]研究發現，在小鼠模型中敲除聚合蛋白基因可以導致染色體錯誤分離概率升高，繼而引起早期胚胎發育阻滯。

2.后期延遲(anaphase lagging)：后期延遲是指姐妹染色單體未能與紡錘體有效結合，或姐妹染色單體與紡錘體結合但沒能正常進入子代細胞最終丟失，在同一胚胎內形成單體-二倍體細胞系嵌合[7]。后期延遲是嵌合體胚胎形成的主要機制，Ioannou等[9]通過對廢棄的第5天胚胎研究發現，單體-二倍體細胞系嵌合的嵌合體胚胎發生率是三體-二倍體細胞系嵌合的7倍，這一結果也得到了Coonen等[10]和Capalbo等[11]人的證實。此外，后期延遲機制還是三體-二倍體細胞系嵌合胚胎自我修正的機制，三倍體細胞通過后期延遲機制清除多余的一條染色體恢復至正常二倍體細胞，稱之為“三體營救”[11]。

3.內復制(endoreplication)：內復制是指細胞周期功能障礙，有絲分裂開始后迅速結束，染色體復制完成但胞質分裂未完成，或是一次有絲分裂剛剛結束，子代細胞的一條或多條染色體又再次復制但不分裂。內復制會導致多倍體-二倍體細胞系嵌合的胚胎出現，這類胚胎在通過“三體營救”機制自我糾正后還會出現染色體數目正常但表型異常的單親二倍體(uniparental disomy，UPD)胚胎。UPD即同一胚胎內兩條同源染色體均來自于同一親本。UPD最常見于15、7、11和16號染色體[12]，人群發生率低，但會導致嚴重的發育遲緩和智力障礙，給家庭和社會帶來沉重負擔。

4.斷裂-融合-橋循環(breakage-fusion-bridge)：這種異常分離會導致復雜的染色體重排而出現嵌合[13]，即染色體片段融合形成雙著絲粒染色體。有絲分裂過程中每個著絲粒被拉向相反的紡錘體兩極形成橋狀物，然后染色體在新的位置斷裂，斷裂染色體片段復制后再融合開始新的循環[7]。

三、嵌合體胚胎的發生率

嵌合體胚胎的檢出率依賴于不同的檢測方法和檢測平臺，既往文獻報道的嵌合體胚胎的檢出率差異較大，從30%到90%不等[14]。歐洲人類生殖與胚胎學會指南(ESHRE)提到嵌合體胚胎的發生率為40%～60%[15]，這與各個中心早期使用熒光原位雜交技術(FISH)進行胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)檢測有關。FISH可以對單個細胞進行遺傳學檢測，是最早應用于PGT的檢測方法，其依賴于特定的檢測探針，無法對全部染色體進行篩查，且操作方法復雜、錯誤率高，不同生殖中心的實驗室環境(溫度、PH值、濕度等)也會影響其檢測結果，現在除了滿足平衡異位等特殊的檢測需求，已經很少在PGT中使用。隨著全染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)技術的發展，單核苷酸多態性分析微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP arrays)、微陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)以及二代測序技術(next generation sequencing，NGS)等檢測技術可以同時對24條染色體進行檢測，其中NGS相較于其它檢測方法具有高敏感度和準確性的優勢[16]。其與aCGH檢測技術相比較，aCGH將囊胚期活檢的5～10個細胞作為一個整體分析，對整倍體細胞和非整倍體細胞混合檢測；而NGS技術可對單個細胞的24條染色體進行逐一檢測，更有利于嵌合體胚胎的檢出。

有文獻報道，嵌合體胚胎的發生率在卵裂期最高，為15%～75%[17]；囊胚期有所下降，在20%～33%之間[3]。由于囊胚期嵌合體發生率較低，且囊胚期活檢對胚胎發育潛能的損傷較小，目前各生殖中心傾向于選擇第5天或第6天的囊胚進行滋養外胚層活檢。囊胚期活檢相較于卵裂期活檢的優勢在于，囊胚期時對滋養外胚層細胞進行活檢不損傷內細胞團，對胚胎的發育潛能損傷小，且大量的文獻指出活檢細胞控制在5～10個之間對胚胎的種植率幾乎沒有影響。囊胚期嵌合體檢出率下降與胚胎的自我糾正有關，在胚胎組基因激活后非整倍體細胞占比越大的胚胎死亡越快，存活的嵌合體胚胎通過凋亡和丟失等方式清除異常細胞。對鼠胚的研究發現，在囊胚成熟的過程中，位于內細胞團的非整倍體細胞在發育過程中逐漸凋亡，而位于滋養層細胞的非整倍體細胞表現為生長發育受阻[18]。因此選擇囊胚期活檢不僅可以減少對胚胎的損傷還可以增加對胚胎的利用率。

不同染色體異常在嵌合體胚胎中的發生率不同，21和22號染色體最短且是端著絲粒染色體最易發生染色體異常分離，嵌合體胚胎的檢出率分別是4.01%和3.81%。1、2和6號染色體較減數分裂在有絲分裂過程中更易發生錯誤，嵌合體胚胎的發生率(分別為3.23%、3.62%和3.04%)高于非整倍率發生率(分別為1.29%、1.55%和1.62%)。1、2、5、9號和X等染色體的著絲粒在有絲分裂過程中不穩定，易出現結構畸變，產生部分非整倍體-二倍體細胞系嵌合胚胎[16]，特殊的部分非整倍體嵌合胚胎在卵裂期的發生率為24.3%，囊胚期略低為15.6%[19]。

四、嵌合體胚胎研究中的難點

嵌合體胚胎研究中面臨的最大難點是PGT對嵌合體胚胎診斷的準確性。PGT檢測準確性的影響因素包括活檢細胞的代表性和遺傳檢測技術的靈敏度和可靠性。滋養外胚層細胞活檢的準確性受諸多因素影響，如染色體嵌合的類型、異常細胞的占比、活檢過程的操作方式、活檢細胞數量及活檢部位等。目前的研究證實嵌合體胚胎中的異常細胞是隨機均勻分布于滋養外胚層和內細胞團內的，Chuang等[20]發現無論是活檢靠近還是遠離內細胞團的滋養外胚層細胞，其嵌合體的檢出率與內細胞團本身基本一致。為了不損傷胚胎的植入潛能，滋養外胚層的活檢細胞數局限在5～10個之間，但Gleicher等[21]通過數學模型計算，提出假設嵌合細胞在滋養外胚層中分布均勻，至少需要活檢27個滋養外胚層細胞才能代表整個囊胚染色體核型。Maxwell等[22]取不同部位的滋養外胚層細胞進行多次的重復檢測，發現兩次結果的一致率為48.3%。但也有學者證實同時利用FISH和aCGH技術對內細胞團和3個不同位置的滋養外胚層細胞進行活檢，其一致率可達到97%[23]。而且我們通過滋養層細胞的活檢結果，來選擇整倍體胚胎進行植入，有效地提高了妊娠率，降低了流產率。囊胚期滋養外胚層細胞活檢基本可以代表內細胞團的遺傳學狀態，但這一結論還需要更大數據量的臨床對照實驗來證實。

此外，NGS技術對嵌合體胚胎雖具有較高的靈敏度和檢出率，但因NGS讀取數據的長度短于傳統的測序技術，而且在序列拼接過程中錯誤率為0.1%～15%，對于大量數據的分析也面臨著嚴重的挑戰[24]。

五、嵌合體胚胎的臨床結局

嵌合體胚胎是介于整倍體和非整倍體之間的第三種胚胎類型，在無整倍體胚胎可以移植的情況下，可以考慮移植嵌合體胚胎。且隨著PGT檢測技術的發展，囊胚期嵌合體胚胎的檢出率和檢出類型都顯著增加。NGS-PGT的嵌合體檢出率可達到30%[25]。在PGT周期中，優先為患者移植整倍體胚胎，但檢測結果只有嵌合體胚胎時，是否可以移植仍不明確，有的中心通過設置臨界點來規定胚胎是否可以移植，一般認為異常細胞比例<40%的胚胎可以移植[26]，異常細胞>50%的嵌合體胚胎臨床妊娠率、植入率和活產率均顯著低于整倍體囊胚(分別為15.2% vs. 46.4%，24.4% vs. 54.6%和15.2% vs. 46.6%)[27]，不建議移植。嵌合體胚胎的發育潛能同時還受嵌合類型影響，例如：兩條以及兩條以上染色體嵌合的復雜嵌合體胚胎只有10%的植入率[26]，而染色體部分非整倍體嵌合的胚胎其發育潛能幾乎不受影響。Fragouli等[28]報道，經NGS診斷為嵌合體的44枚胚胎中，染色體部分非整倍體嵌合占比為32%，它的妊娠結果與整倍體胚胎相似，活產率為57.1%，自然流產率無明顯差異。

與非整倍體胚胎不同，嵌合體胚胎也可以成功種植并獲得正常活產。可能機制有：(1)從嵌合體胚胎中分離活檢細胞時存在取樣誤差，滋養層細胞活檢結果并不完全代表內細胞團中的遺傳狀態，PGT出現了假陽性結果。(2)胚胎發育過程中可能存在自我糾正機制，包括：優勢細胞選擇性分布、整倍體細胞代償以及異常細胞凋亡和丟失等。截止2018年全球有近100例嵌合體胚胎成功種植[29]，Fragouli等[28]移植44個嵌合體胚胎后有12個最終正常活產。但與滋養外胚層細胞活檢正常的囊胚種植率(55.8%)相比，嵌合體胚胎的種植率(30.1%)顯著降低。Besser等[30]發現，移植嵌合體胚胎和選擇廢棄嵌合體胚胎重新移植整倍體胚胎的兩組患者間的持續妊娠率也有顯著差異(27.6% vs. 51.2%)。

目前還未有移植嵌合體胚胎后出生的兒童長期大量的隨訪結果。但有研究發現，除了17號染色體外，幾乎所有出現嵌合的染色體都有成功妊娠的報道[26]。新生兒的臨床表現以及嚴重程度與其染色體類型、異常細胞比例以及分布相關。嚴重的新生兒嵌合可導致先天畸形、自閉癥和精神發育遲緩等。例如Turner綜合征中嵌合體占比37.8%，嵌合型為45，X/46，XX的患者易發生甲狀腺功能不全，少部分嵌合型為45，X/47，XXX的Turner綜合患者還表現為精神異常[31]。

六、嵌合體胚胎的遺傳咨詢

移植嵌合體胚胎雖然存在種植率低、流產率高且有出生缺陷胎兒的風險，但經過遺傳咨詢后并非所有患者都會選擇丟棄嵌合體胚胎。Besser等[30]對98名只有嵌合體胚胎的患者進行遺傳咨詢后，仍有32.7%的患者選擇移植嵌合體胚胎。因單倍體胚胎不能存活(除45，X外)，而某些三倍體胚胎可導致胎兒身體或認知障礙，所以對于最終選擇移植嵌合體胚胎的患者，PGDIS在關于嵌合體胚胎遺傳咨詢指南中建議：(1)相較于二倍體-三倍體細胞系嵌合，優先移植二倍體-單倍體細胞系嵌合。(2)當選擇移植二倍體-三倍體細胞系嵌合胚胎時，應根據嵌合的程度以及受累染色體選擇最優胚胎，優先考慮轉移包括：1，3，4，5，6，8，9，10，11，12，17，19，20，22，X和Y染色體的三體嵌合；與單親二倍體(14，15)相關嵌合三體胚胎的優先級較低；與宮內生長遲緩(2，7，16號染色體)相關嵌合三體胚胎的優先級較低；能夠存活(13，18，21號染色體)的嵌合三體胚胎優先級最低[32]。同時充分告知患者嵌合體胚胎結局的不確定性和流產、胎兒異常、必要時終止妊娠等各種可能的風險，并需在妊娠14周時進行產前診斷通過羊膜腔穿刺術(amniocentesis)確診胎兒染色體核型。

七、結語

胚胎嵌合是在胚胎發育過程中染色體異常分離所導致的特殊現象，有關其形成機制以及不同的胚胎嵌合類型對胚胎發育的具體影響尚不清楚，隨著PGT技術的發展，NGS對于嵌合體的診斷更加靈敏，檢出率更高。嵌合體胚胎具有一定的生存潛能，但其種植率、妊娠率均低于整倍體胚胎。對患者進行PGT遺傳咨詢后，少數患者在無整倍體胚胎情況下，最終選擇移植嵌合體胚胎，成功妊娠后需接受羊水穿刺檢查，并對出生嬰兒需進行長期隨訪，以積累更多的嵌合體胚胎數據。