富血小板血漿宮腔灌注對反復種植失敗婦女妊娠結局的影響

劉科鵬，李麗斐，成慧，劉媛，張學紅*

(1.蘭州大學第一醫院生殖專科醫院，蘭州 730000；2.西北民族大學附屬醫院，蘭州 730000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功的關鍵是優質的胚胎和子宮內膜同步化發育以及兩者之間的協調配合。盡管近年來輔助生殖技術有了很大發展，但反復種植失敗(RIF)仍然是患者和臨床醫生共同面臨的難題。很多患者經歷多次助孕失敗，導致很大的精神和經濟負擔。Thornhill等[1]將RIF定義為至少連續3次IVF周期植入失敗，其中每個周期移植1～2枚高質量的胚胎或多次移植胚胎數量共計≥10枚仍未獲得臨床妊娠。IVF-ET過程中，反復種植失敗的發生率為7.7%～11.1%，植入失敗與母親因素及胚胎因素有關，母親因素包括子宮解剖異常、血栓形成、降低的子宮內膜容受性和免疫因素；胚胎因素與遺傳異?；蚺咛ス逃械钠渌蛩赜嘘P[2]。其中由于子宮內膜容受性下降導致的植入失敗占到總數的2/3[3]。因此，采取有效措施改善子宮內膜容受性成為RIF研究的熱點。通過患者全血離心獲得的血漿血小板濃縮物稱為富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)，2015年，Chang等[4]首先描述了子宮腔內灌注PRP可以治療薄型子宮內膜。Zadehmodarres等[5]也描述了PRP促進子宮內膜發育的有效性。本研究通過回顧性分析，探討使用宮腔內灌注PRP能否提高反復種植失敗婦女子宮內膜容受性進而提高再次IVF-ET后的臨床妊娠率。

一、資料與方法

1.研究對象：選擇2018年2月至2019年1月于蘭州大學第一醫院生殖專科醫院就診的RIF婦女，再次IVF-ET治療前接受過PRP灌注的患者；另取同期未經PRP灌注的匹配RIF患者為對照組。納入標準：(1)年齡≤40歲；(2)有連續3次及以上胚胎種植失敗史；(3)不孕因素主要包括盆腔輸卵管因素、排卵障礙、男方因素；(4)宮腔鏡檢查，子宮形態正常；(5)卵巢功能正常[血清FSH、LH、抗苗勒氏管激素(AMH)水平均處于正常范圍]，自然排卵周期或使用促性腺激素刺激卵泡發育周期中，至少有1個卵泡發育至直徑≥18 mm。排除標準：(1)既往有雌激素相關性腫瘤病史；(2)宮腔鏡檢查顯示宮腔形態異常、宮腔粘連、內膜息肉、黏膜下子宮肌瘤等；(3)內膜異常增生、內膜結核及內膜炎等內膜病變；(4)子宮腺肌癥；(5)雙側輸卵管積水；(6)甲狀腺功能異常、血液病等全身性疾病。本研究共納入127例患者。觀察組63例患者于再次行IVF-ET術前行PRP宮腔灌注，對照組64例患者IVF-ET術前未行PRP宮腔灌注。

2.控制性超促排卵方案：月經前黃體中期使用長效促性腺激素釋放激動劑(GnRH-a)(曲普瑞林，輝凌，德國)1.4 mg 肌肉注射，14 d后進行B超和血清E2水平檢查，如達到垂體降調節標準，開始注射重組人FSH(果納芬，默克雪蘭諾，意大利)75～150 U/d，通過B超和激素水平(血清FSH、LH、E2、孕酮)監測卵泡發育，主導卵泡直徑達到18～20 mm時，肌肉注射重組人HCG(艾澤，輝凌，德國)250 μg，36 h后取卵。取卵后即開始肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d進行黃體支持，取卵3 d后進行胚胎移植。根據胚胎數目和形態進行評分，選擇評分最高的2～3枚胚胎進行移植。

3.PRP的制備及應用：如先前報道，PRP由自體血液采用兩次離心法制備[6]。月經結束后第3天使用預先裝有5 ml 3.2%檸檬酸鈉抗凝溶液的注射器抽取15 ml患者自身靜脈血，立即于18℃下以相對離心力300g離心 10 min。離心后形成三層，底部為紅細胞層，上清液為血漿層，中間為血沉棕黃層。將上面的2層轉移到新的無菌離心管中，然后在18℃下以700g再次離心15 min。丟棄約四分之三的上清液后，從離心管底部吸取1 ml PRP，添加凝血酶粉末(25 U/ml，Sigma-Aldrich，美國)和氯化鈣(20 mmol/ml，Kalmia，美國)以激活PRP。PRP激活后立即進行宮腔灌注，患者于檢查床上取膀胱截石位，用窺陰器暴露宮頸，消毒外陰及陰道。使用注射器吸取1 ml PRP后連接移植管。移植管穿過宮頸口，將PRP緩慢推入宮腔內，灌注后患者靜臥30 min。

4.妊娠判斷：胚胎移植后14 d查血β-HCG水平，血β-HCG≥50 IU/L定義為HCG陽性。30 d后行B超檢查宮腔，了解有無胚囊及其數目，B超檢查探及宮內孕囊中有胚芽及心管搏動即為臨床妊娠。

5.觀察指標及計算：子宮動脈搏動指數(PI)、子宮動脈阻力指數(RI)；胚胎種植率=B超檢查發現宮內孕囊數/移植胚胎總數×100%。臨床妊娠率=獲得臨床妊娠的患者數/總患者數×100%。

二、結果

1.兩組患者的一般資料及促排卵情況：兩組患者的年齡、不孕年限、不孕原因等差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組患者血清基礎 FSH 值、Gn 使用天數及總量和獲卵數等差異均無統計學意義(P>0.05)(表 1)。

2.治療后兩組間子宮內膜厚度、子宮動脈血流參數比較：HCG注射日和胚胎移植日觀察組子宮內膜厚度均顯著大于對照組(P<0.05)，子宮動脈搏動指數(PI)、子宮動脈阻力指數(RI)均顯著小于對照組(P<0.05)(表 2)。

3.兩組患者的胚胎移植情況及妊娠結局：統計結果顯示，兩組患者移植胚胎數和優質胚胎數均無顯著性差異(P>0.05)，觀察組的胚胎種植率和臨床妊娠率均顯著高于對照組(P<0.01)(表 3)。

表1 兩組患者一般資料及促排卵情況比較[(-±s)，n(%)]

表2 兩組間HCG注射日和胚胎移植日內膜厚度、子宮動脈血流參數比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 兩組患者胚胎移植及妊娠結局比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.01

三、討論

在自然月經周期中，當胚胎發育到胚泡期時，人的子宮內膜會在排卵后約6 d接受植入。胚泡與子宮內膜間發生一系列復雜的相互作用，導致胚胎附著在宮腔上皮上，隨后侵入基質，從而與母體脈管系統建立聯系，良好的子宮內膜容受性是胚胎能夠順利植入的前提[7]。B超下子宮內膜的性狀如厚度、形態、血流等可以直觀地反映子宮內膜狀況，也是評估子宮內膜容受性最重要的指標。子宮內膜血流、厚度、類型在月經周期中表現出規律性的變化。圍排卵期子宮內膜上皮細胞、內皮細胞、間質細胞迅速增生，表現為子宮內膜厚度增加，腺體增生，螺旋動脈血流灌注更加豐富，RI、PI、臍動脈舒張壓血流速度高低比值(S/D值)降低，血流呈低阻力，子宮內膜血流灌注情況可以直接反映胚胎著床部位的微環境，對于受精卵成功著床非常重要，形態上則出現“三線征”。三線征同樣提示了良好的子宮內膜血流灌注，胚胎種植前子宮內膜主要表現為細胞的增生、分化和血液供應的增加，且腺體與間質發育同步。另一個子宮內膜容受性的形態學指標為胞飲突，其作用可能為使宮腔上皮可以更好地吸附胚泡。因此，胚泡著床能力與胞飲突的數量存在正相關關系。胞飲突的數量可以作為子宮內膜容受性和植入窗打開的微觀形態學指標，分泌期胞飲突的增多意味著子宮內膜處于最佳狀態。

PRP是自體血液的一部分，是通過患者全血離心后獲得的血小板濃縮物。血小板在其細胞質顆粒中儲存了各種生長因子和細胞因子，這些顆粒在激活因子(例如細胞外基質膠原蛋白)存在下會發生胞吐作用從血小板中釋放出來[8]。PRP中發現的多種細胞因子和生長因子包括轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)和白細胞介素8(IL-8)[9]，因此，向患者給予PRP宮腔灌注也代表了大量細胞因子和趨化因子的輸注。細胞因子和生長因子在胚胎植入過程中發揮的重要作用是眾所周知的，由血細胞儲存和釋放的這些信號分子可以促進細胞的遷移，增殖和分化[10]，進而促進正常生理條件下的子宮內膜生長和胚胎植入過程。本研究結果顯示，HCG注射日和胚胎移植日觀察組子宮內膜厚度均顯著大于對照組(P<0.05)，子宮動脈搏動指數(PI)、子宮動脈阻力指數(RI)均顯著小于對照組(P<0.05)，這意味著PRP宮腔灌注可以增加子宮內膜厚度，改善子宮內膜血流，繼而改善了子宮內膜容受性。

使用自體PRP進行生育治療的第1份報告來自于不孕的母馬，結果表明交配前接受PRP宮腔灌注的母馬其妊娠率顯著增加[11]。另一項使用體外牛子宮內膜炎癥模型的研究表明，經PRP處理的細胞具有更高的增殖速率，并且參與植入的若干基因表達更高[12]。Chang等[4]報道了薄型子宮內膜(<7 mm)患者輸注PRP后子宮內膜生長和妊娠結局更好。之后另外幾項研究分別報道了 PRP 宮腔灌注可以改善薄型子宮內膜生長和妊娠結局[13-14]。本研究回顧性分析發現將PRP應用于反復種植失敗婦女再次IVF-ET過程中行PRP宮腔灌注能改善臨床妊娠結局，觀察組與對照組相比較，胚胎種植率(20.69% vs 9.09%)、臨床妊娠率(42.85% vs 18.75%)均顯著提高(P<0.01)，與以往研究結果一致。由于對PRP宮腔灌注的研究時間并不長，我們對其機制和原理知之甚少。一項體外實驗表明，活化的PRP可以促進人子宮內膜上皮細胞、子宮內膜間質成纖維細胞、子宮內膜間充質干細胞(MSC)、骨髓源性MSC和子宮內膜腺癌細胞的遷移、增殖和分化[15]。這些數據為使用自體PRP增強子宮內膜容受性提供了機制原理的初步證據，最新的研究報告顯示PRP宮腔灌注可以促進新血管生成，該研究表明，不孕婦女在凍融胚胎移植周期中子宮內膜欠佳時進行PRP灌注，通過多普勒超聲觀察到的血管信號數量顯著增加，到達子宮內膜3區和4區的血管數量增加[16]。因此我們推測PRP宮腔灌注可以加速內膜的生長和與胚胎發育的同步化，促進子宮內膜螺旋動脈的生成，增加內膜血流，增加胚胎種植的營養供給，改善子宮內膜容受性。

綜上所述，PRP宮腔灌注能提高反復種植失敗婦女再次IVF-ET術后的胚胎種植率和臨床妊娠率，改善妊娠結局。