精液處理前和精子優化處理后孵育時間對夫精宮腔內人工授精臨床結局的影響

楊志偉，耿亞松，李國臻，陶林林，鄭波

(邢臺不孕不育專科醫院，邢臺生殖與遺傳?？漆t院，邢臺 054000)

夫精宮腔內人工授精技術(IUI-AIH)是將丈夫精液在體外經過優選處理去除精漿，通過注入等方法輔助活動良好的精子進入女性宮腔，促使精卵自然結合以獲得妊娠生育的輔助生殖技術[1-2]。對于治療男性因少精子癥、弱精子癥、液化異常、性功能障礙和生殖器畸形等導致的不育和女性宮頸因素、生殖道畸形及心理因素導致性交不能等引起的不孕，是一種經濟、有效、安全而應用廣泛的一線治療手段[1]。然而，其妊娠率受多種因素制約，目前夫精人工授精的妊娠率只有8%～25%[3]，而且有關IUI周期妊娠率的主要影響因素尚存爭議。本研究主要探討精液優化處理前后精子孵育時間對宮腔內人工授精妊娠結局的影響，以期為宮腔內人工授精標準流程提供合理的依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年10月至2019年3月在我院生殖醫學中心接受AIH-IUI治療的107對夫婦的臨床資料。納入標準：(1)女方年齡≤35周歲，首次行IUI；(2)男性不育因素為少精子癥、弱精子癥、液化異常、性功能障礙、生殖器畸形等；女性不孕因素為宮頸因素、生殖道畸形及心理因素導致性交不能。排除標準：(1)卵泡未破裂黃素化綜合征者；(2)男女一方患有生殖泌尿系統急性感染或性傳播疾?。?3)一方患有嚴重的遺傳、軀體疾病或精神心理疾患；(4)優化處理后活動精子總數≥10×106個。

二、研究方法

1.促排卵方案：女方月經周期規律者選擇自然周期排卵；月經周期不規律或者排卵障礙時采用促排卵周期，促排卵周期月經第3～5天給予來曲唑(伊美舒，浙江海正)口服、肌肉注射尿促性素(樂寶得，珠海麗珠)或者聯合用藥，持續用藥5 d，陰道超聲動態監測卵泡發育情況及子宮內膜厚度。觀察卵泡直徑>16 mm或者子宮內膜厚度>8 mm時，使用尿LH試紙(昆明云大生物技術)進行定性檢測。尿LH陽性，則抽血進行血清激素定量檢測有無LH峰。當B超顯示卵泡直徑>18 mm、血LH出峰，給予HCG(珠海麗珠)10 000 U 肌肉注射，次日B超檢測有無排卵，若無排卵安排排卵前和排卵后兩次授精，若排卵則安排一次授精。如直徑≥14 mm的優勢卵泡≥3個，放棄該治療周期或改體外授精胚胎移植周期。

2.精液處理：男方禁欲2～7 d，手淫取精于無菌容器內，室溫液化后進行精液常規檢查。用G-MOPS PLUS(Vitrolife，瑞典)將SpermGrad(Vitrolife，瑞典)稀釋成90%和45%兩種濃度的液體，先用巴斯德吸管在離心管中加入1 ml 45%溶液，在其下層試管底部緩慢加入1 ml的90%溶液，然后在頂層緩慢加入所有精液，300g離心15 min。去上層液，底層精子沉淀轉移到1.5 ml G-MOPS PLUS 中，300g離心5 min，洗滌兩次。收集底層精子轉入到0.5 ml G-MOPS PLUS中混勻。鏡檢后室溫孵育，待行人工授精。

3.人工授精：術前排空膀胱，取膀胱截石位，打開無菌人工授精包，用溫鹽水沖洗外陰，沖洗完畢后，鋪無菌治療巾于患者雙腿，將溫鹽水倒入小量杯，置窺陰器，清洗陰道及宮頸分泌物，清洗完畢。用1 ml BD注射器抽吸精液約0.5 ml，連接人工授精導管，將導管插入宮腔，緩慢將精液注入宮腔距宮頸6～6.5 cm處，注入完畢后，將人工授精管緩慢撤出。術后抬高臀部，臥床30 min。當日常規使用黃體酮(安琪坦，博賞醫藥，法國)口服或陰道給藥進行黃體支持。

4.分組：精液處理前孵育時間分為A1(0～15 min)、A2(15～45 min)和A3(>45 min)三組，兩次授精的液化時間不一致，計為兩個周期；記錄精子優化處理后孵育時間分為B1(0～15 min)、B2(15～45 min)和B3(>45 min)三組，兩次授精的孵育時間不一致，計為兩個周期。比較不同分組各組間的臨床妊娠率差異。

5.觀察指標：授精后28～35 d B超檢查，見孕囊確定臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠例數/總人工授精例數×100%。參考《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版，精液量、精子濃度、前向運動(PR)精子百分比和正常形態精子百分比等正常者診斷為正常精子[4]，正常精子率=診斷正常精子例數/總人工授精例數×100%。

三、統計學處理

結 果

一、一般資料比較

本研究共納入107對夫婦(授精次數共173次)，按臨床妊娠結局分為妊娠組和非妊娠組。通過比較發現，妊娠組和非妊娠組女方年齡、原發不育占比、正常精子率、授精次數、宮腔注入前向運動精子總數的差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 妊娠組和非妊娠組一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、精液處理前孵育時間對IUI-AIH臨床妊娠的影響

精液處理前不同孵育時間組(A1、A2和A3)的臨床妊娠率分別為16.67%、29.73%和13.85%，其中A2組的臨床妊娠率顯著高于A3組(P<0.05)，較A1組略有增高(P>0.05)；各組間女方年齡、原發不育占比、正常精子率、宮腔注入PR精子總數的差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 精液處理前不同孵育時間對臨床妊娠結局的影響比較[(-±s)，n(%)]

注：例數按授精次數算。與A1組比較，#P<0.05；與A2組比較，*P<0.05

三、優化后精子孵育時間對IUI-AIH臨床妊娠的影響

精子優化后不同孵育時間組(B1、B2和B3)的臨床妊娠率分別為18.52%、20.59%和15.91%，B2組的臨床妊娠率相對其他兩組有增高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；各組間女方年齡、原發不育占比、正常精子率、宮腔注入PR精子總數的差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 精子優化后不同孵育時間對患者臨床妊娠結局的影響[(-±s)，n(%)]

注：例數按授精次數算。與B1組比較，*P<0.05；與B2組比較，#P<0.05

四、相關因素與IUI臨床妊娠的Logistics回歸分析

納入可能影響臨床妊娠的相關因素，多因素Logistic回歸分析結果顯示，女方年齡、原發不育占比、正常精子率、授精次數、宮腔注入PR精子總數與IUI臨床妊娠率無顯著相關性(P>0.05)，但隨著原發不育占比和正常精子率的增加，IUI臨床妊娠率有增高趨勢；處理前孵育時間與IUI臨床妊娠率呈非線性相關，處理前孵育時間在15～45 min間(A2組)可顯著提高臨床妊娠率(P<0.05)；優化后精子孵育時間與IUI臨床妊娠率的關系具有相似的趨勢，孵育時間在15～45 min間(B2組)有提高臨床妊娠率的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 影響妊娠因素的Logistic回歸分析

討 論

IUI-AIH是一種經濟、有效、安全而應用廣泛的一線輔助生殖治療手段[5]，由于無創的操作和極少的配子胚胎體外培養時間，優先被不孕不育癥夫婦選用。然而，針對于精液在體外的孵育時間的規范鮮有報道，本研究主要通過不同孵育時間臨床結局的比較和多因素相關分析闡明精液處理前孵育時間和優化后精子孵育時間對IUI-AIH臨床結局的影響。

通過對妊娠組和非妊娠組相關資料的比較和相關因素與臨床妊娠的相關性分析，本研究納入資料的女方年齡、原發不育占比、正常精子率、授精次數、宮腔注入前向運動總數均無統計學差異。國玉蕊等[1]的研究顯示，同一周期行雙次人工授精未提高人均妊娠率，顯著提高了周期妊娠率，兩次人工授精能避免卵母細胞錯過最佳受精時間。我們的患者資料均為首次行人工授精，但未顯示兩次人工授精的優勢，可能由于卵母細胞受精時間窗維持在12～24 h，射精后精子受精能力也可持續到48～72 h。考慮到兩次授精的孵育時間不一致，記為兩個周期進行統計分析。

精子隨精漿排出體外后，精漿的微環境與精子發生的微環境有著比較大的差異[6]，可能與精子的成熟相關。有報道精漿中血清同型半胱氨酸、INH-B和鋅-α2糖蛋白等多種因子與精子的活性相關[7-8]。Bjorndahl等[9]發現精子染色質結構的狀態在體外可能會有所不同，這取決于精子在射精后儲存在精液中的消耗鋅條件，因此精漿與精子的共孵育有助益精子成熟。我們發現較少的處理前孵育時間不能獲得較好的IUI臨床妊娠結局，可能是因為精子活化相關物質過早分離、不利于精子活化。但是，射精后孵育時間的延長不利于精子存活，反而使受精的有害物質逐漸積累。Crha等[10]研究指出精漿中高濃度的Hcy有直接的細胞毒性，造成內膜的損傷，氧化應激物質(ROS)的過度產生，轉甲基作用受到抑制，甚至出現基因的異常表達[10-11]，因此過長的精液處理前孵育時間不利于人工授精等輔助生殖技術獲得較好的妊娠結局。我們的研究結果證實，精液處理前的孵育時間>45 min組相對于孵育時間在15～45 min組具有較差的臨床妊娠結局。

女性生殖道不同位置具有不同的理化性質，精子染色體的解聚過程與這些理化性質的動態變化緊密相關[9]，正確的時間點到達合適的位置有利于卵母細胞正常受精。梁嘉穎等[12]的研究指出，精液優化處理后過早和過晚行人工授精不利于臨床妊娠。隨著孵育時間的延長精子染色體逐漸解聚，精卵孵育60 min后，精子染色體解聚度可從25%增長為80%，精子染色體解聚度<70%時不能使卵子正常受精[12-13]。精子表面上吸附著具有氧化酶活性的成分，可以穩定精子的各種結構，精子運動的能量主要來源于精子中段進行的糖酵解產生的三磷酸腺苷(ATP)[10]，隨著精子孵育時間的增加具有氧化酶活性的成分和ATP會被大量消耗，不利于受精。此外有研究證實，頂體反應的發生具有時間依賴性，體外孵育時間越長，頂體反應率越高[14-15]。精子在培養液中發生過度的自發頂體反應會影響卵母細胞正常受精進而降低臨床妊娠率，同時隨著精子體外孵育時間的增加精子DNA碎片率也會顯著增加，影響精子的受精能力[16]，因此應該避免較長的精子優化處理后的孵育時間。我們的研究顯示精子優化處理后時間在15～45 min時沒有顯著提高宮腔內人工授精的臨床妊娠，但精液優化處理后精子孵育時間<15 min和孵育時間>40 min時的AIH-IUI 臨床妊娠率有降低的趨勢。

綜上所述，精液處理前的孵育時間與宮腔內人工授精妊娠結局顯著相關，我們建議精液采集后15～45 min內開始優化處理，同時應盡量保證處理后孵育時間在15～45 min內行宮腔內人工授精。本研究樣本量較小，有待大樣本量持續驗證，為獲得更加穩定的IUI臨床妊娠提供參考。