布氏菌病活疫苗（Rev.1株）凍干保護(hù)劑工藝的研究

布氏菌病是在全球范圍內(nèi)廣泛流行的重大人畜共患病。該病不僅嚴(yán)重影響著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康、穩(wěn)定發(fā)展，更是給公共衛(wèi)生、食品安全等領(lǐng)域帶來巨大危害，對人類健康也造成了嚴(yán)重威脅。在布氏菌病流行地區(qū)從業(yè)畜牧養(yǎng)殖及獸醫(yī)工作者感染該病現(xiàn)象非常普遍，受到了業(yè)內(nèi)高度關(guān)注。

國內(nèi)廣泛使用的布氏菌病疫苗主要為布氏菌活疫苗（S2株）。該疫苗雖然在國內(nèi)生產(chǎn)和使用數(shù)十年，在布氏菌病防控中發(fā)揮了一定的作用，但實(shí)踐證明，其防控效果是有限的，難以達(dá)到有效控制或消滅布氏菌病的效果。目前國際上普遍推薦布病活疫苗（Rev.1株），該疫苗在歐洲、美洲地區(qū)多個國家使用多年，其穩(wěn)定性、安全性及保護(hù)性等性能指標(biāo)已得到廣泛認(rèn)可，并在多個國家應(yīng)用后根除了該病，取得了巨大成效。因此我公司積極研制該疫苗，以期早日進(jìn)入市場，為布病防控做出貢獻(xiàn)。

1 材料

1.1 菌液 布魯氏菌Rev.1株菌液，批號分別為：SY001批，SY002批，SY003批；3批發(fā)酵菌液的菌數(shù)分別為：14.4×109CFU/mL、15.5×109CFU/mL、15.1×109CFU/mL；由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.2 試劑 蔗糖，購自津市科盟化工工貿(mào)有限公司，批號20140521；明膠，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號20150116；脫脂奶粉，購自新西蘭，批號2014001；硫脲，購自津市科盟化工工貿(mào)有限公司，批號20140924；氫氧化鈉，購自津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號20150120。

1.3 稀釋液 滅菌生理鹽水稀釋液200mL，批號5329001，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.4 設(shè)備 凍干機(jī)、灌裝系統(tǒng)、電子平、酸度計(jì)、儲液桶等。

2 方法

2.1 凍干保護(hù)劑的制備

2.1.1 蔗糖脫脂乳保護(hù)劑的制備 分別稱取蔗糖75g和135g脫脂奶粉加入到盛放有1200mL注射用水的10L儲液桶中，持續(xù)攪拌待其充分溶解后用注射用水定容至1500mL，用硫酸紙、牛皮紙包扎儲液桶瓶口，以118℃、30min高壓滅菌后待用；每批制備3桶蔗糖脫脂乳保護(hù)劑，共計(jì)制備3批。

2.1.2 含硫脲的蔗糖明膠保護(hù)劑的制備 分別稱取蔗糖300g、75g硫脲加入到盛放有1000mL注射用水的10L儲液桶中，持續(xù)攪拌使其徹底溶解；稱取150g明膠，用電磁爐加熱溶解明膠后再倒入儲液桶中用注射用水定容至1500mL混合均勻，用2%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，用硫酸紙、牛皮紙包扎儲液桶瓶口，以121℃、1.5h高壓滅菌后待用；每批制備3桶含硫脲的蔗糖明膠保護(hù)劑，共計(jì)制備3批。

2.1.3 蔗糖明膠保護(hù)劑的制備 稱取蔗糖300g加入到盛放有1000mL注射用水的10L儲液桶中，持續(xù)攪拌使其徹底溶解；稱取150g明膠用電磁爐加熱溶解明膠后再倒入儲液桶中用注射用水定容至1500mL混合均勻，用2%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，用硫酸紙、牛皮紙包扎儲液桶瓶口，以121℃、1.5h高壓滅菌后待用；每批制備3桶明膠蔗糖保護(hù)劑，共計(jì)制備3批。

2.2 凍干活疫苗的制備

2.2.1 蔗糖脫脂乳凍干活疫苗制備 分別采取上述3批菌液與蔗糖脫脂乳保護(hù)劑，以菌液與保護(hù)劑配比為6∶1，將定量的菌液無菌轉(zhuǎn)入儲液桶內(nèi)混合均勻，以4ml/瓶分裝，經(jīng)冷凍真空干燥后制成凍干活疫苗。

2.2.2 含硫脲的蔗糖明膠保護(hù)劑凍干活疫苗制備 分別采取上述3批菌液與蔗糖脫脂乳保護(hù)劑，以菌液與保護(hù)劑配比為6∶1，將定量的菌液無菌轉(zhuǎn)入儲液桶內(nèi)混合均勻，以4mL/瓶分裝，經(jīng)冷凍真空干燥后制成凍干活疫苗。

2.2.3 蔗糖明膠保護(hù)劑凍干活疫苗制備 分別采取上述3批菌液與蔗糖脫脂乳保護(hù)劑，以菌液與保護(hù)劑配比為6:1，將定量的菌液無菌轉(zhuǎn)入儲液桶內(nèi)混合均勻，以4mL/瓶分裝，經(jīng)冷凍真空干燥后制成凍干活疫苗。

2.2.4 每批采用相同批號的菌液分裝數(shù)量相同的不同配方保護(hù)劑，采用相同的凍干曲線重復(fù)實(shí)驗(yàn)3批。凍干曲線見圖1。

圖1 凍干曲線

2.3 物理性狀 觀察不同配方保護(hù)劑各批次凍干活疫苗的外觀及顏色，加稀釋液后是否迅速溶解。

2.4 活菌計(jì)數(shù) 將不同配方保護(hù)劑各批次凍干活疫苗分別用滅菌生理稀釋溶解至4mL，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 性狀 不同配方保護(hù)劑各批次凍干活疫苗均為淡黃色疏松團(tuán)塊，易與瓶壁分離，加入稀釋液后迅速溶解，符合要求。詳見表1～3。

3.2 活菌計(jì)數(shù) 不同配方保護(hù)劑各批次凍干活疫苗，凍干后活菌含量差異不明顯，凍干前后活菌數(shù)損失比例均小于5%。詳見表4～6。

表1 SY001批凍干活疫苗物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果

表2 SY002批凍干活疫苗物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果

表3 SY003批凍干活疫苗物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果

表4 SY001批不同配方保護(hù)劑凍干活疫苗凍干后的活菌含量

表5 SY002批不同配方保護(hù)劑凍干活疫苗凍干后的活菌含量

表6 SY003批不同配方保護(hù)劑凍干活疫苗凍干后的活菌含量

4 結(jié)論

采用我公司成熟的布氏菌病活疫苗（S2株）凍干曲線凍干布氏菌病活疫苗（Rev.1株），三種不同配方的凍干保護(hù)劑對疫苗的凍干效果影響不明顯，但蔗糖明膠保護(hù)劑凍干后，活菌含量略高于蔗糖脫脂乳；而凍干時加入適量的硫脲，則可以在一定程度上增加疫苗的耐熱性。因此，綜合凍干前后活菌數(shù)損失量、疫苗的粘稠度對灌裝設(shè)備和凍干效果的影響、活菌計(jì)數(shù)誤差等各項(xiàng)因素，我們選擇蔗糖明膠保護(hù)劑，加入終濃度為1%硫脲的工藝作為布氏菌病活疫苗（Rev.1株）大規(guī)模生產(chǎn)的凍干工藝，即選用20%蔗糖、10%明膠凍干保護(hù)劑，與菌液以1∶6的配比比例混合，再加入終濃度約為1%的硫脲制備布氏菌病活疫苗（Rev.1株）。