布氏菌病活疫苗（Rev.1株）凍干保護劑工藝的研究

布氏菌病是在全球范圍內廣泛流行的重大人畜共患病。該病不僅嚴重影響著畜牧養殖業的健康、穩定發展，更是給公共衛生、食品安全等領域帶來巨大危害，對人類健康也造成了嚴重威脅。在布氏菌病流行地區從業畜牧養殖及獸醫工作者感染該病現象非常普遍，受到了業內高度關注。

國內廣泛使用的布氏菌病疫苗主要為布氏菌活疫苗（S2株）。該疫苗雖然在國內生產和使用數十年，在布氏菌病防控中發揮了一定的作用，但實踐證明，其防控效果是有限的，難以達到有效控制或消滅布氏菌病的效果。目前國際上普遍推薦布病活疫苗（Rev.1株），該疫苗在歐洲、美洲地區多個國家使用多年，其穩定性、安全性及保護性等性能指標已得到廣泛認可，并在多個國家應用后根除了該病，取得了巨大成效。因此我公司積極研制該疫苗，以期早日進入市場，為布病防控做出貢獻。

1 材料

1.1 菌液 布魯氏菌Rev.1株菌液，批號分別為：SY001批，SY002批，SY003批；3批發酵菌液的菌數分別為：14.4×109CFU/mL、15.5×109CFU/mL、15.1×109CFU/mL；由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.2 試劑 蔗糖，購自津市科盟化工工貿有限公司，批號20140521；明膠，購自北京奧博星生物技術有限公司，批號20150116；脫脂奶粉，購自新西蘭，批號2014001；硫脲，購自津市科盟化工工貿有限公司，批號20140924；氫氧化鈉，購自津市北聯精細化學品開發有限公司，批號20150120。

1.3 稀釋液 滅菌生理鹽水稀釋液200mL，批號5329001，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.4 設備 凍干機、灌裝系統、電子平、酸度計、儲液桶等。

2 方法

2.1 凍干保護劑的制備

2.1.1 蔗糖脫脂乳保護劑的制備 分別稱取蔗糖75g和135g脫脂奶粉加入到盛放有1200mL注射用水的10L儲液桶中，持續攪拌待其充分溶解后用注射用水定容至1500mL，用硫酸紙、牛皮紙包扎儲液桶瓶口，以118℃、30min高壓滅菌后待用；每批制備3桶蔗糖脫脂乳保護劑，共計制備3批。

2.1.2 含硫脲的蔗糖明膠保護劑的制備 分別稱取蔗糖300g、75g硫脲加入到盛放有1000mL注射用水的10L儲液桶中，持續攪拌使其徹底溶解；稱取150g明膠，用電磁爐加熱溶解明膠后再倒入儲液桶中用注射用水定容至1500mL混合均勻，用2%氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，用硫酸紙、牛皮紙包扎儲液桶瓶口，以121℃、1.5h高壓滅菌后待用；每批制備3桶含硫脲的蔗糖明膠保護劑，共計制備3批。

2.1.3 蔗糖明膠保護劑的制備 稱取蔗糖300g加入到盛放有1000mL注射用水的10L儲液桶中，持續攪拌使其徹底溶解；稱取150g明膠用電磁爐加熱溶解明膠后再倒入儲液桶中用注射用水定容至1500mL混合均勻，用2%氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，用硫酸紙、牛皮紙包扎儲液桶瓶口，以121℃、1.5h高壓滅菌后待用；每批制備3桶明膠蔗糖保護劑，共計制備3批。

2.2 凍干活疫苗的制備

2.2.1 蔗糖脫脂乳凍干活疫苗制備 分別采取上述3批菌液與蔗糖脫脂乳保護劑，以菌液與保護劑配比為6∶1，將定量的菌液無菌轉入儲液桶內混合均勻，以4ml/瓶分裝，經冷凍真空干燥后制成凍干活疫苗。

2.2.2 含硫脲的蔗糖明膠保護劑凍干活疫苗制備 分別采取上述3批菌液與蔗糖脫脂乳保護劑，以菌液與保護劑配比為6∶1，將定量的菌液無菌轉入儲液桶內混合均勻，以4mL/瓶分裝，經冷凍真空干燥后制成凍干活疫苗。

2.2.3 蔗糖明膠保護劑凍干活疫苗制備 分別采取上述3批菌液與蔗糖脫脂乳保護劑，以菌液與保護劑配比為6:1，將定量的菌液無菌轉入儲液桶內混合均勻，以4mL/瓶分裝，經冷凍真空干燥后制成凍干活疫苗。

2.2.4 每批采用相同批號的菌液分裝數量相同的不同配方保護劑，采用相同的凍干曲線重復實驗3批。凍干曲線見圖1。

圖1 凍干曲線

2.3 物理性狀 觀察不同配方保護劑各批次凍干活疫苗的外觀及顏色，加稀釋液后是否迅速溶解。

2.4 活菌計數 將不同配方保護劑各批次凍干活疫苗分別用滅菌生理稀釋溶解至4mL，按照現行《中國獸藥典》附錄進行活菌計數。

3 結果

3.1 性狀 不同配方保護劑各批次凍干活疫苗均為淡黃色疏松團塊，易與瓶壁分離，加入稀釋液后迅速溶解，符合要求。詳見表1～3。

3.2 活菌計數 不同配方保護劑各批次凍干活疫苗，凍干后活菌含量差異不明顯，凍干前后活菌數損失比例均小于5%。詳見表4～6。

表1 SY001批凍干活疫苗物理性狀檢驗結果

表2 SY002批凍干活疫苗物理性狀檢驗結果

表3 SY003批凍干活疫苗物理性狀檢驗結果

表4 SY001批不同配方保護劑凍干活疫苗凍干后的活菌含量

表5 SY002批不同配方保護劑凍干活疫苗凍干后的活菌含量

表6 SY003批不同配方保護劑凍干活疫苗凍干后的活菌含量

4 結論

采用我公司成熟的布氏菌病活疫苗（S2株）凍干曲線凍干布氏菌病活疫苗（Rev.1株），三種不同配方的凍干保護劑對疫苗的凍干效果影響不明顯，但蔗糖明膠保護劑凍干后，活菌含量略高于蔗糖脫脂乳；而凍干時加入適量的硫脲，則可以在一定程度上增加疫苗的耐熱性。因此，綜合凍干前后活菌數損失量、疫苗的粘稠度對灌裝設備和凍干效果的影響、活菌計數誤差等各項因素，我們選擇蔗糖明膠保護劑，加入終濃度為1%硫脲的工藝作為布氏菌病活疫苗（Rev.1株）大規模生產的凍干工藝，即選用20%蔗糖、10%明膠凍干保護劑，與菌液以1∶6的配比比例混合，再加入終濃度約為1%的硫脲制備布氏菌病活疫苗（Rev.1株）。