焦亡在常見消化道疾病中的機制研究

洪坤巧，邱虎，余保平

(武漢大學人民醫院消化內科，武漢 430060)

自Cookson和Brennan[1]在2001年繼壞死和細胞凋亡后首次提出焦亡的術語，焦亡便引起學術界高度的關注，在全身系統疾病中的作用機制和疾病的發生發展、診斷、預后方面被廣泛深入探索。最初在巨噬細胞中發現胱天蛋白酶(caspase)參與疾病免疫性應答，后來在肝細胞和腎臟細胞均發現了參與細胞焦亡的caspase和炎性小體等物質，并參與炎癥的發生和纖維化[2-3]。此外，焦亡還參與腫瘤的侵襲、種植和轉移，通過阻斷焦亡的信號轉導通路或剔除Gasdermin D(GSDMD)能延緩腫瘤的進展[4]。細胞焦亡涉及精確的信號級聯，由一組確定的效應分子執行，形成了較復雜的網絡系統，并伴隨大量的炎癥介質釋放，細胞焦亡是機體與生俱來的自我保護和對細胞內外有害物質的應答反應。細胞焦亡根據始動因子不同分為經典途徑和非經典途徑，通過細胞內脂多糖結合caspase-11、caspase-4、caspase-5或炎性體(caspase-1)激活炎性caspase，激活的炎性caspase切割GSDMD，從自身抑制性GSDMD-C結構域釋放N端p30結構域，然后活化的GSDMD-N與質膜中的脂質結合并形成大的寡聚孔，導致細胞內容物的釋放和細胞死亡[5]。現就焦亡在消化道疾病相關機制的研究進展予以綜述。

1 調節細胞焦亡的相關分子

1.1模式識別受體家族 焦亡發生的第一步是配體與受體[包括Toll樣受體、NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、C型凝集素受體和維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體，這4種受體是一組進化保守的受體]的識別啟動先天性免疫應答，然后，識別結合到胞外或胞內病原微生物或者傷害性刺激的相關分子模式(病原相關分子模式、損傷相關分子模式及其他免疫相關分子模式)，最終啟動焦亡級聯反應[6]。在胃腸道相關疾病中涉及最多的是NLRs，它富含亮氨酸重復序列，包括多個亞系(NLRA、NLRB、NLRC和NLRP)，其中又以NLRC和NLRP最突出；NLRC蛋白在其N端具有一個或多個caspase募集結構域(CARD)，通過它們可以直接與受體相互作用蛋白2或pro-caspase-1相互作用形成炎性小體；NLRP蛋白則與之不同，其具有熱蛋白樣結構域(PYD)，NLRP有14個家庭成員即NLRP1～14，其中NLRP3是炎性小體的重要組成部分，參與多種疾病的發生，它具有C端富含亮氨酸重復序列、中心NACHT結構域和N端PYD，當被激活時，PYD允許通過同型PYD-PYD相互作用募集細胞凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein，ASC)[7]。

1.2傳感器炎性小體 炎性小體是一種細胞溶質多蛋白復合物，控制炎癥反應，協調宿主防御病原微生物。目前已鑒定并被廣泛接受的炎性小體復合物有7種，即NLRP1、NLRC4、AIM2(absent in melanoma 2)、人γ干擾素誘導蛋白16、熱蛋白、NLRP3和非經典的caspase-4[8]。普遍認為，炎性小體由NLRP3、ASC和pro-caspase-1組成，炎性小體傳感器通過識別和響應病原體(脂多糖、病原微生物DNA和細菌鞭毛蛋白)或危險信號(離子通量、自身DNA和ATP)起作用[9]。ASC是一個銜接蛋白，由PYD和CARD組成，通過連接NLR的PYD和pro-caspase-1的CARD起作用，ASC作為中間橋梁將上游炎性體傳感器分子橋接至pro-caspase-1，誘導催化具有活性caspase-1的形成，切割白細胞介素(interleuki，IL)-1β前體為成熟的IL-1β，通過細胞膜上的通透性轉運孔釋放到細胞外啟動下游[10]。

1.3調節器caspase caspase是哺乳動物具有的含15個成員的高度保守的天冬氨酸特異性半胱氨酸家族，在調節細胞死亡、發育、炎癥和免疫相關中起關鍵作用[11-12]。caspase和多數的酶一樣最初以無活性的酶原存在，只有在被炎性小體激活后才能發揮功能。caspase-8/10是具有4個結構域的結構，包括小亞基、大亞基、CARD和死亡效應結構域(DED)，caspase-1/2/4/5/9/12缺乏DED基序，但包含其他結構域；效應子caspase-3/6/7則需要將其他caspase切割成小亞基和組裝成活性酶的大亞基，這些活化的caspase可以切割底物，從而導致細胞死亡和炎癥；caspase-1/4/5/11通過切割GSDM家族成員尤其是GSDMD引發焦亡，以誘導膜孔的形成和質膜破裂[13]。caspase-1作為焦亡的啟動子，促進炎癥因子成熟和釋放，但它使炎癥因子釋放的具體機制目前仍不清楚。有學者認為，caspase-1早期切割細胞核內的自身抗原1促進炎癥介質的釋放，而活化的自身抗原1對caspase-1形成正反饋，這個過程與GSDMD形成的細胞膜孔道無關[14]。

1.4執行者GSDMD家族 GSDMD是caspase作用的底物，同時也是經典途徑和非經典途徑的共同底物，是焦亡的關鍵物質；GSDMD被caspase-1或caspase-11切割成N端和C端，C端能抑制N端的功能，這種自身抑制作用在GSDMD被裂解后喪失，而GSDMD-C并不是無活性的片段，GSDMD-C的過表達可以阻斷脂多糖誘導的細胞焦亡[15-17]。GSDMD-N端部分能夠易位至脂質膜中，寡聚化形成內徑>3.5 nm的孔道，細胞焦亡時，胞質內容物的流出最終導致膜裂解[18]。GSDMD在焦亡最后環節發揮著至關重要的作用，是IL-1β分泌的中間媒介，甚至N端片段也能促發細胞死亡，在N端被修飾后其功能也被相應破壞，GSDMD在焦亡中的多種功能也越來越突出[17,19]。

1.5細胞焦亡的經典途徑和非經典途徑 細胞焦亡通常由人體內促炎性caspase-1/4/5的激活引發，從而導致炎癥介質(IL-1β和IL-1)釋放，GSDMD被切割、膜孔形成，最終導致細胞裂解。焦亡主要受兩種主要途徑調節，即caspase-1誘導的經典炎性途徑和caspase-4/5誘導的非經典炎性途徑。經典途徑：胞質模式識別受體(如NLRP1/2/3/6/7和NLRC4的CARD結構域)識別病原等相關分子模式，隨之激活炎性小體，炎性小體使caspase-1活化，直接切割GSDMD，游離的N端移至內膜，與膦脂結合形成膜孔道，同時caspase-1促進IL-1β和IL-18成熟和分泌，最終細胞內物質、鉀離子透過GSDMD-N孔，炎癥介質大量釋放，由此導致細胞焦亡[20]。非經典途徑：人的caspase-4/5通過其CARD直接識別革蘭陰性菌脂多糖，而在大鼠中脂多糖能夠直接進入細胞并激活caspase-11[21]，作用于與經典途徑一樣的底物GSDMD，后面的環節大致與經典途徑相似。目前認為，經典和非經典途徑之間并不是獨立的，兩者相互作用可以放大炎癥反應和焦亡[22]。

2 焦亡與消化道相關疾病

2.1焦亡與肝病 肝炎常見于各型肝炎病毒、藥物、酒精、自身免疫等因素損傷引起的炎癥，炎癥如果得不到控制，可刺激肝星狀細胞的活化和促纖維化因子的上調，最終發展為肝硬化。GSDMD在多種細胞類型和組織中表達，除常見的巨噬細胞和單核細胞外，還包括肝細胞[23-24]，參與炎癥因子的釋放和組織纖維化[25]。Xu等[26]也證明了人類非酒精性肝病中GSDMD能顯著促進肝細胞因子分泌、巨噬細胞浸潤，并激活核因子κB信號通路，推動肝脂肪變性向肝炎的轉化。焦亡的終末環節釋放大量促炎物質，由庫普弗細胞釋放的IL-1β促進肝星狀細胞的活化，增加了細胞外基質和膠原蛋白的沉積，從而促進肝纖維化和隨后的肝硬化[27]。有學者進一步做了相關研究，結果顯示，條件缺失的Ⅰ型IL-1受體通過阻斷IL-1驅動的局部和全身炎癥細胞因子和趨化因子水平，減輕肝損傷，同時，NLRP3炎性小體的表達和capase-1的活化被抑制，抑制細胞炎癥性質的釋放，也能阻止病變的進展[28]。NLRP3炎性小體激活可誘導肝細胞壞死、肝臟炎癥和纖維化[27,29]。在體外和細胞水平上同時驗證了在急性肝損傷模型中與焦亡相關的蛋白caspase-1和NLRP3 的表達水平顯著增加，給予相應的抑制劑預處理肝細胞，結果均顯示，細胞凋亡率下降，細胞損傷減輕[30]。在肝臟的缺血再灌注損傷中，二十二碳六烯酸通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑抑制肝細胞焦亡，從而改善心肌缺血再灌注誘導的損傷[31]。因此，焦亡在肝臟的損傷、炎癥、肝硬化等疾病的發生、發展環節中發揮了重要作用，藥物阻斷或靶向基因剔除成為潛在的治療靶點。

2.2焦亡與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD) IBD是一組原因不明的慢性腸道炎癥疾病，容易復發且難治愈，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎。焦亡是先天免疫應答的重要組成部分，焦亡信號通路以及IL-1β的釋放在炎癥反應疾病中起著關鍵作用，炎性小體參與IBD的具體發病機制較復雜，包括不當的黏膜免疫應答和腸道微生物群紊亂等，capase-1、IL-1β和IL-18在IBD的表達也較正常組織升高[32]；caspase-1在被炎性小體激活后促進IL-1β的復合物的成熟，負責釋放IL-1家族成員(如IL-1β和IL-18)，在細胞焦亡中扮演著重要的角色，在應用capase-1的抑制劑后IBD的癥狀顯著改善[33]。IL-1β和IL-18都是有效的促炎細胞因子，對先天和適應性免疫系統具有廣泛的影響，IL-1β的上調與疾病活動和IBD中活動性病變的存在相關，用IL-1阻斷劑治療可降低疾病的嚴重程度[34]。NLRP3是焦亡經典信號通路的炎性小體，免疫失調引起炎性小體的活化，NLRP3炎性體激活與IBD息息相關，在動物模型中，1,25-二羥維生素D3的前體膽固醇乳劑可以通過抑制炎性小體減輕結腸炎或者自身免疫性心肌炎的癥狀[35-36]。IBD的發生最常見的是免疫性因素，免疫相關的GTP酶M通過作用于NLRP3和ASC阻斷其寡聚化來阻礙炎性小體組裝，同時抑制炎癥因子的成熟，免疫相關的GTP酶M在克羅恩病實驗小鼠模型中具有減輕焦亡和腸道炎癥的保護作用，藥物的臨床相關價值還需要大量的研究提供依據[37]。在骨相關的間充質基質細胞中，通過啟動焦亡促進炎癥反應，其抑制劑66PR可能通過降低NLRP3和caspase-11的表達抑制炎性小體，提高細胞存活率，在IBD的治療方面有較好的療效，具有很好的應用前景[32-33]。

2.3焦亡與相關消化道腫瘤

2.3.1焦亡與肝癌 caspase-1作為啟動子在巨噬細胞、單核細胞和其他細胞中引發了焦亡，在腫瘤中的作用已逐漸被發現[8]。焦亡使大量炎癥介質釋放，促進肝炎、肝硬化的發生，而肝硬化進一步發展成肝癌。而Chu等[38]在肝癌組織中觀察到caspase-1的表達顯著下調，焦亡信號通路的改變影響腫瘤的生長和轉移，caspase-1的抑制劑Ac-YVAD-CMK可間接增強HepG2細胞的活力以及遷移和侵襲能力。caspase-1在腫瘤的進展中發揮著重要的作用，caspase-1通過焦亡通路調節結腸上皮細胞的增殖和凋亡，而caspase-1缺陷小鼠具有增強腫瘤形成的作用[39]。同樣，肝X受體控制癌細胞增殖和死亡，有研究者用激動劑特異性誘導肝X受體β，發現pannexin 1和NLRP3依賴性caspase-1的活化可抑制結腸腫瘤生長，抑制caspase-1成為腫瘤治療的新標靶[39-40]。

2.3.2焦亡與胰腺癌 胰腺癌是一種病死率極高的惡性腫瘤，其起病隱匿、發展迅速，小干擾RNA、非編碼RNA、缺氧等通過作用于靶基因或相關信號通路促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，而細胞焦亡在胰腺癌中發揮的作用尚不明確，焦亡與人類胚胎發育、穩態維持和疾病病理學有關，由于信號通路的改變，癌癥導致細胞分裂與細胞死亡之間失去平衡[40]。細胞接收特定的死亡信息后發生腫脹、爆破，產生細胞因子，并最終死亡。由caspase-1介導的經典途徑的表達缺乏可能導致炎癥介導的腫瘤進展，STE20樣激酶1通過活性氧類誘導的細胞焦亡抑制胰腺癌進展，焦亡參與胰腺癌的發病機制，并且可能是治療胰腺癌的新的腫瘤靶標[41]。

2.3.3焦亡與胃癌 GSDMD參與焦亡的關鍵環節，是焦亡的最終和直接執行者。GSDMD在胃癌中的表達水平較正常組織降低，可顯著促進體內和體外腫瘤的增殖，GSDMD的下調通過激活胞外信號調節激酶、信號轉導及轉錄激活因子3以及調節胃癌中的細胞周期相關蛋白來加速S/G2期細胞轉變[4]。GSDM家族的其他成員(GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME/DFNA5和GSDMA3)在破膜的細胞毒性方面具有相似的功能[42]。以往認為主要是GSDMD參與了焦亡，新近的研究表明，GSDME通過調節caspase-3促進炎性小體的活化，與腫瘤等疾病的發生相關[43-44]。Wang等[45]證明，GSDME依賴性caspase-3的焦亡也參與胃癌的發生，并且5-氟尿嘧啶的治療可以誘導GSDME表達的胃癌細胞焦亡，由此認為，焦亡通路以及相關蛋白表達在消化道相關腫瘤中是下調的，通過藥物上調可以抑制腫瘤的生長、轉移。此外，在腫瘤高表達GSDMD與侵襲性狀相關，GSDMD表達下調可限制腫瘤的生長和擴散，可作為判斷腫瘤預后的指標[4]。

3 小 結

焦亡是先天免疫的重要組成部分，焦亡中的炎性小體NLRP3的高效抑制劑JC124可顯著減輕腦創傷后炎癥應答的癥狀[46]。此外，NLRP3在炎癥免疫等多數疾病中是上調的，而在腫瘤中呈現下調的趨勢，在肝癌中NLRP3表達下調，17β-雌二醇通過激活NLRP3抑制肝癌的發生與進展，成為治療腫瘤的新靶標[47]。caspase-1參與多種急慢性炎癥和免疫失調的發生，caspase-1抑制劑還能促進肺泡和血管發育，對肺具有保護作用，可轉化運用到臨床肺發育不成熟的早產兒[48-49]。在類鼻疽感染的小鼠模型中發現，GSDMD引發焦亡，直接發揮殺菌作用[50]，而且抑制GSDMD可以減輕肝缺血再灌注和庫普弗細胞的焦亡[19]。總之，焦亡作為炎癥細胞死亡在消化道相關疾病的調節機制仍需不斷地完善和補充，為攻克疑難疾病提供新方案和理論依據。