miR-29b在慢性淋巴細胞白血病中的研究進展

李高強，李燕

(1.新疆醫科大學研究生學院，烏魯木齊 830001； 2.新疆維吾爾自治區人民醫院血液病科，烏魯木齊 830001)

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一種成熟B淋巴細胞在外周血、骨髓、脾臟和淋巴結異常增殖的血液腫瘤[1-2]。CLL的發生可能與免疫、感染、遺傳等因素有關。CLL是西方國家最常見的成人白血病類型之一，發病率約為5.1/10萬，占成人白血病的25%～40%[3]。據調查顯示，在亞洲地區，成人CLL白血病不足5%[4]，發病率遠遠低于歐美國家[5]。目前，CLL的診斷及分期主要依靠外周血、骨髓涂片、流式細胞學及染色體核型分析等多種檢測手段。由于CLL患者病情異質性較大，為準確判斷預后及采取相應治療手段，需對初治CLL患者病情進行客觀評估。目前已明確分期、β2微球蛋白、乳酸脫氫酶、免疫球蛋白重鏈可變區(immunoglobulin heavy chain variable region，IGVH)及TP53(tumor protein p53)基因突變等指標與CLL預后密切相關，但對于CLL相關的分子機制尚不清楚，因此探索能將疾病進展和臨床預后緊密聯結的新型生物學標志物顯得尤為重要[6]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種由8～25個堿基對組成的非編碼RNA，通過信使RNA降解或抑制翻譯來調節基因的表達，同時還具有轉化激活、穩定和誘導RNA的功能；miRNA參與分化、增殖、調節細胞周期及細胞凋亡等細胞活動，這些過程在人類癌癥中失衡，并導致癌癥的發生、發展[7]。研究發現，與CLL發病及病情進展相關的miRNA有miR-29s、miR-155、miR-181b、miR-223、miR-17-92、miR-146a等[3-4，8-9]，其中一部分起到抑癌作用，另一部分發揮致癌作用?，F就miR-29b在CLL中的有關研究予以綜述。

1 miR-29b

1.1miR-29家族 miR-29家族主要包括miR-29a、miR-29b(miR-29b-1和miR-29b-2)、miR-29c，其中miR-29b-1和miR-29b-2分別位于人染色體7q32.3和1q32.2。成熟miR-29家族具有相同的堿基序列AGCACCA，在序列上具有很大相似性，其中miR-29b與細胞核內物質結合起作用，具有核定位AGUGUU序列。miR-29b在哺乳動物細胞代謝蛋白質結構降解氨基酸分解過程中發現，miR-29b分子是針對支鏈α酮酸復合物的二氫硫辛酰胺支鏈?；D移酶組分的miRNA，與之結合時阻止其翻譯[10]。研究顯示，miR-29b作為一種腫瘤抑制因子，通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤基因DNA甲基化、減少腫瘤增殖和增加化療敏感性來抑制腫瘤的進展，雖然部分腫瘤以及參與非惡性疾病的發病機制尚未完全闡明，但可以明確miR-29b參與了腫瘤細胞調控分化、凋亡及轉錄[11]。

1.2miR-29b的作用 研究表明，miR-29b在大多數腫瘤中起到抑癌作用，在婦科腫瘤(如乳腺癌、宮頸癌)、消化道腫瘤(如肝癌、胃癌)、血液腫瘤(急性髓系白血病、多發性骨髓瘤等)中的表達下調[10-12]。在某些腫瘤(如結腸癌)中miR-29b表達上調，預示病情較重，預后差[13]。miR-29b通過以下生物學效應發揮作用。①抑制血管生成：miR-29b靶向血管內皮生長因子A路徑，通過促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B抑制血管生成，影響癌細胞的生長[14]；②抑制癌細胞增殖和轉移：CC趨化因子配體11、CXC趨化因子配體14水平增高促進癌細胞生長增殖及產生耐藥，miR-29b通過下調p38-信號轉導及轉錄激活因子1信號通路及CC趨化因子配體11、CXC趨化因子配體14來抑制癌細胞的增殖與轉移[15]；③誘導細胞凋亡：TP53是一種編碼蛋白p53的抑癌基因，在細胞分裂、凋亡與核酸損傷修復中扮演著重要角色，在miR-29b誘導HeLa和MCF7細胞中合成肽LK-L1C/K6W/L8C，通過促進miR-29b的表達、增強p53活性以及提高p53的穩定性來刺激細胞凋亡[16]；④促進細胞衰老：MYC是重要的抗衰老基因，致癌轉錄因子MYC恢復程序基因表達，促進細胞增殖和腫瘤形成，miR-29b通過與MYC蛋白的信使RNA結合而抑制其表達，促進細胞衰老[17]；在Burkitt淋巴瘤細胞和急性早幼粒細胞白血病中，MYC與細胞物質結合，抑制細胞內miR-29b的表達[18]；⑤調節細胞周期：miR-29b調節細胞周期的途徑不同，在受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1+)CLL細胞中，miR-29b過表達可下調DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1和DNMT3A表達，通過減少特異性β1糖蛋白SP1(specificity protein 1)的表達和增加細胞周期抑制劑p21的表達來調節細胞周期[19]。miR-29b通過靶向髓樣細胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)、細胞周期蛋白CCND2(cyclin D2)的3′端非翻譯區，誘導G1/S期細胞周期停滯并促進凋亡來抑制肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖[20]。

2 miR-29b與CLL

目前有關miR-29b在CLL中的研究較少。有研究表明，IGVH基因無突變狀態的CLL患者預后較差，且具有17p缺失和(或)TP53基因突變、染色體復雜核型異常的患者預后最差，而11q缺失也是預后不良的標志[21-22]。在Visone等[23]通過實時熒光定量聚合酶鏈反應驗證的與CLL相關的32種miRNAs中，有9種miRNAs(包括miR-29b)的表達與特定的核型有關，表明miR-29b和miR-29c在11q缺失的CLL中表達較低；進一步比較亞組之間的分析結果表明，在17p-侵襲性病例中，miR-29b、miR-29c均下調，這一發現與這些患者的臨床過程相一致，提示miR-29b對于評估伴有17p缺失的CLL患者的腫瘤負荷具有重要的綜合診斷價值。Santanam等[24]對侵襲性CLL(29例)和惰性CLL(33例)患者進行研究，運用反轉錄聚合酶鏈反應方法檢測miR-29b表達水平，結果發現，miR-29b在CLL患者中過表達，與普通CD19+B細胞相比，miR-29b在惰性CLL中高4～4.5倍，在侵襲性CLL中高3倍，但miR-29b在侵襲性CLL與惰性CLL中表達水平無差異。Zhu等[25]研究表明，CLL患者miR-29b的表達與IGVH的突變狀態相關性很大，IGVH基因未突變患者較IGVH突變患者具有較低的miR-29b水平，且差異有統計學意義(P<0.05)。另外，Fulci等[26]通過反轉錄聚合酶鏈反應發現，在54例CLL患者中miR-29b過表達，而且IGVH突變組較未突變組CLL細胞上調更顯著。上述研究均表明，在CLL患者中，miR-29b的低表達與疾病進展密切相關。但目前有部分研究結果顯示CLL患者與正常人miR-29b的表達無差異。例如，Furtado等[3]研究發現，在Binet A期CLL、高計數單克隆B細胞淋巴細胞增多癥及正常的B細胞中miR-29b表達水平相似，未見顯著差異；Santanam等[24]比較了46例CLL患者和9例正常淋巴細胞者miR-29b的表達水平，結果顯示，70%的CLL患者與正常人B細胞相比，miR-29b具有相似的表達水平，其中，miR-29b的表達水平與正常健康對照者相比，46例CLL樣本中7例miR-29b的表達水平較高，32例表達水平相當，7例表達水平較正常健康對照者顯著降低，而miR-29b的水平在IGVH突變的和未突變的樣本中沒有差異。

此外，多項研究表明，miRNA發生基因突變和單核苷酸序列的改變可以影響miRNA的表達，序列變異可能與CLL生物學特性和發病機制有關；在CLL患者的miRNA基因中發現單核苷酸序列新的突變，其中大多存在于成熟miRNA中，可改變特定miRNA的二級結構[27-28]。Kminkova等[28]研究顯示，含有多態性插入+107+A的pri-miR-29b-2的CLL患者的B細胞，與正常B細胞相比，miR-29b表達水平降低；在CLL患者中，攜帶多態性插入的miR-29b的表達水平在IGVH未突變組較IGVH突變組降低，可能影響CLL中B細胞的生物學特性，而沒有序列變異的CLL患者可能存在不同的調節機制。

3 miR-29b與靶基因

一個miRNA可以有多個靶基因，多個miRNA可以共同調節同一個靶基因，這些靶基因共同參與多種細胞信號轉導過程，又受到細胞中多個調節機制(如轉錄調節、表觀遺傳學修飾)的調控，構成了復雜的信號轉導調控網絡。miR-29b在腫瘤進展中至關重要，可以調節轉錄因子SP1、蛋白酪氨酸激酶、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、過氧蛋白、細胞周期激酶、DNMT3a/3b、T細胞淋巴瘤/白血病1(T-cell lymphoma/leukemia 1，TCL-1)、MCL-1等多種靶基因的表達[10，25，29-30]。

3.1miR-29b與TCL-1 TCL-1蛋白最初在人的T細胞幼淋巴細胞白血病中發現[31]。TCL-1是一種在前T細胞、樹突狀細胞及發育中的B細胞內表達的蛋白。有研究認為，由于TCL-1的基因過表達導致CLL的發生，在B細胞內，TCL-1可與原癌基因c-Jun 氨基端激酶、c-Fos互相協同，抑制激活蛋白1依賴的轉錄；此外，還可與核因子κB共激活物p300/cAMP應答元件結合蛋白結合，激活核因子轉錄途徑，抑制細胞凋亡[31]。研究表明，TCL-1的表達與miR-29b的表達水平呈負相關，TCL-1的高表達與IGVH未突變及CD38+、ZAP70+高表達以及11q缺失相一致，與CLL的侵襲性疾病特征相關[25]。研究表明，miR-29b表達水平與IGVH突變狀態顯著相關，與正常對照組相比CLL患者B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)和TCL-1表達水平顯著上調，在IGVH未突變組CLL細胞中，miR-29b低表達，TCL-1高表達，作為miR-29b的預測靶點，盡管在CLL樣本中TCL-1的表達從完全缺失變為強表達，但在相當多的CLL樣本中，TCL-1的表達顯著增加[32]。但Santanam等[24]發現，在人與小鼠實驗中，TCL-1在侵襲性CLL中表達下調，miR-29b與TCL-1在惰性CLL中均較正常CD19+B淋巴細胞高表達。另外，TCL-1在CLL調節微環境已知的信號增強子和促存活分子中具有積極作用。研究發現，骨髓間充質干細胞的TCL-1相關信使RNA和蛋白質上調與TCL-1相互作用的原癌基因c-Fos/c-Jun氨基端激酶的降低相平行，基質介導的TCL-1增加與TCL-1調節的miRNA(miR-29b、miR-181b和miR-34b)的水平降低相關[33]。

3.2miR-29b與MCL-1 Bcl-2是一種定位于線粒體和內質網的蛋白，Bcl-2通過減少細胞色素的釋放而成為線粒體途徑的關鍵調節因子，是細胞凋亡的關鍵抑制劑[34]。MCL-1是一種Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，是活化信號轉導及轉錄激活因子3通路下游的靶點，在大多數CLL細胞中，Bcl-2家族受到廣泛的細胞過程的動態調控，包括B細胞抗原受體的連接和通過CD40、血管內皮生長因子和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路的信號轉導[35-36]。有研究發現，MCL-1和miR-29b不僅參與器官的纖維化，還介導細胞增殖與凋亡[37]。MCL-1通過白細胞介素-6/白細胞介素-8結合miR-29b的3′端非翻譯區被直接下調，進而通過miR-29b/白細胞介素-6或白細胞介素-8/MCL-1L軸影響CD中的腸纖維化，miR-29b不僅能與MCL-1特異性結合，還能抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡，從而抑制MCL-1蛋白活性[38]。miR-29b可以抑制MCL-1和CCND2蛋白的表達，而沉默的MCL-1和CCND2則可以消除PASMCs增殖和凋亡的變化，miR-29b通過抑制MCL-1和CCND2從而抑制PASMCs的細胞增殖并促進PASMCs凋亡[20]。研究發現，miR-29b可通過對原癌基因MCL-1和TCL-1的負調控，在具有TP53異常的侵襲性CLL中發揮抑癌作用[39]。促凋亡和抗凋亡信號在CLL患者中聚集在MCL-1上，表明該蛋白在調節該疾病中起關鍵作用。組蛋白去乙酰酶(histone deacetylases，HDACs)是染色質調節酶，通過觸發組蛋白上賴氨酸4的去甲基化，阻止轉錄因子的獲得，從而導致表觀遺傳基因沉默。有研究表明，HDACs在CLL中過表達并介導miR-29b的表觀遺傳沉默，而HDACs抑制劑可以恢復這些miRNAs的表達以拮抗MCL-1蛋白的活性，從而抑制CLL細胞的增殖[26]。多項研究表明，miR-29b的水平降低與Bcl-2和MCL-1的高表達水平密切相關[27，36-37]。HDACs表達水平在CLL中上調，介導了miR-15a、miR-16和miR-29b的表觀遺傳沉默，進一步研究發現，抑制HDACs可誘導miR-15a、miR-16和miR-29b表達上調，導致與線粒體功能喪失和誘導原發性白血病細胞死亡相關的MCL-1蛋白水平降低，使CLL患者存活率降低[26]。

3.3miR-29b與DNMT DNA甲基化是調控表觀遺傳水平基因表達的重要途徑。DNMT催化DNA的甲基化修飾，DNMT活性及功能的改變與多種疾病的發生密切相關，DNA高甲基化可抑制基因轉錄，而低甲基化可使染色質不穩定并導致異常細胞出現。抑癌基因啟動子區的高甲基化是腫瘤發生和發展的重要因素。DNMT家族包括DNMT1(維持甲基化)、DNMT3a和DNMT3b(催化DNA的從頭甲基化)，DNA甲基化通過各種機制在多種癌癥中發生[40]。有研究發現，DNMT1信使RNA水平的降低與miR-29b在急性髓系白血病中的過表達有關，異常的DNA高甲基化通過沉默結構正常的基因來促進急性髓系白血病的發生；miR-29b在急性髓系白血病細胞中的過表達導致DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在RNA和蛋白質水平上的表達顯著降低，從而導致DNA甲基化的水平降低；進一步的實驗表明，miR-29b可通過靶向DNMT1基因的反式激活因子SP1間接下調DNMT1[41]。目前，有研究通過動物實驗證實了DNMT的功能與miR-29b在CLL中的表達水平有關，ROR1在惡性B-CLL細胞中表達，但不在正常B細胞中表達，將miR-29b靶向遞送至ROR1+CLL細胞，可導致DNMT1和DNMT3a的下調、轉錄因子SP1的減少以及細胞周期蛋白激酶抑制劑p21表達的增加；用miR-29b處理的原代CLL細胞中DNMT和SP1下調與調節細胞周期的miR-29b/SP1有關，隨著CLL細胞中miR-29b表達水平增高，DNMT及SP1下降[19]。總之，上述研究通過動物體內和體外實驗證實了ROR1的遞送可以有效地增加miR-29b的表達水平，從而實現阻滯白血病細胞的細胞周期，證明了miR-29b在CLL細胞中的抗腫瘤效果。

3.4miR-29b與DNAJB11 DNAJB11是內質網中的關鍵伴侶BiP的輔助因子，控制分泌和膜蛋白的折疊、運輸及降解。DNAJB11被證實是HEK293細胞系中miR-29b的靶點，并且這些基因(sfpq、hmgb1、serbp1)被強烈建議作為CLL的miRNAs成員的直接目標[42]；研究發現，表達miR-29b的載體中，含有全長DNAJB11 3′端非翻譯區的熒光素酶報告基因的表達降低至約40%，表明DNAJB11確實受到miR-29b的調節；當內源性miRNA與DNAJB11的全長3′端非翻譯區融合時，與對照轉染組相比，miR-29b的抑制導致熒光素酶活性增強；另外，DNAJB11是編碼熱激蛋白40變體的信使RNA，進一步證實，DNAJB11是miR-29b的靶基因[43]。

4 小 結

近年來，miRNA已成為腫瘤發病機制的研究熱點。miRNAs在CLL發生、發展的相關研究已經取得了很大進展，并且基于已發現CLL中存在的靶基因，為靶向治療提供了一定的方向。然而，miRNA參與CLL調控靶基因的機制研究仍在探索中。miR-29b在CLL中表達上調，作為抑癌基因的作用存在，與疾病的發生和發展密切相關。但miR-29b在CLL的發生、發展中調控病理生理進程的作用機制目前尚不清楚，還需通過大量研究得以驗證。miR-29b可能會成為CLL臨床診斷、分期和判斷預后的重要指標。