長鏈非編碼RNA在腎癌中的研究進展

高碩澤，范光銳，楊恩廣，王志平

(蘭州大學第二醫院泌尿系疾病研究所 甘肅省泌尿系疾病研究重點實驗室 甘肅省泌尿系統疾病臨床醫學中心，蘭州730030 )

腎細胞癌占成人惡性腫瘤的2%～3%，占成人腎臟惡性腫瘤的80%～90%[1]。近年來，我國腎癌發病率呈上升趨勢，這對我國腎癌的防治提出了更高的要求。隨著分子研究的發展，現代腫瘤學正在被重塑，這些研究有可能深刻影響腫瘤的管理。尤其長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的研究正在改變人們對腎癌的理解。但是，許多因素仍然阻礙了這一目標的實現。基因表達調控機制仍是未知數，對多種分子改變、對基因調控網絡的細胞后果進行建模仍是一項重大的挑戰，而且靶向分子療法并不總是為患者帶來臨床益處。lncRNA作為不翻譯為蛋白質的RNA轉錄本，在定義細胞個體發育和大部分蛋白質編碼基因方面比信使RNA(messenger RNA，mRNA)更具有特異性[2-3]。lncRNA通過全基因組轉錄調控以及與蛋白質在多種信號通路中的直接相互作用影響細胞功能。lncRNA在泌尿生殖系統惡性腫瘤中的失調，常導致多種致癌機制和治療耐藥性的產生。因此，了解lncRNA在腎癌中的作用至關重要，有利于加強對腎癌的管理。現就lncRNA在腎癌中的失調范圍，lncRNA對當前和未來腎癌治療的潛在影響以及有效融入臨床實踐的可能性予以綜述。

1 lncRNA的生物學功能

lncRNA是長度>200個核苷酸的非編碼RNA，包括非編碼小RNA、干擾小RNA、Piwi相互作用RNA、核仁小RNA和核小RNA。lncRNA的明確特征之一是獲得二級和三級三維結構，主要取決于沃森-克里克堿基配對[4]。這種結構使其既可以發揮基于核酸互補性的RNA相關功能，又可基于其空間構象發揮蛋白質樣功能[5]。

lncRNA可以通過順式或反式調控其靶標基因發揮作用，單個lncRNA可以通過不同的機制調控多個靶標基因[6-7]。lncRNA可以充當支架促進多蛋白復合物的形成(如染色質重塑復合物)，隨后可以被激活以影響基因表達[8]；還可作為促進DNA與蛋白質相互作用的向導，在募集蛋白復合物時增強子RNA，這些復合物誘導DNA環化和靶基因的轉錄激活[9]。相反，lncRNA也可以通過募集轉錄阻遏物調節基因表達[10]；還可以充當引物，與轉錄中涉及的蛋白質結合，以防止其與DNA靶標結合，或者作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)與微RNA(microRNA,miRNA)結合防止其靶基因的負調控[11-12]。lncRNA與mRNA的結合也使得內含子保留，從而促進mRNA的選擇性剪接[13]。

lncRNA廣泛的生物相互作用是其多功能性的關鍵。通過核酸和蛋白質的相互作用，lncRNA可以穩定蛋白質，激活蛋白質復合物并調節整個基因組中的基因表達[10]。在人宮頸癌細胞、人肺成纖維細胞和人包皮成纖維細胞中，有24%的lncRNA表達可以直接與多梳蛋白抑制復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)相互作用，PRC2是一種調節基因表達的主要因子，在惡性腫瘤中經常失調，說明lncRNA在基因表達調控中具有重要作用[14]。lncRNA介導的轉錄調控也可以不依賴PRC2，意味著lncRNA存在其他調控過程[15-16]。但是，某些lncRNA是否可以翻譯為功能性肽是一個新興的問題。總之，lncRNA功能的不斷發展變化，表明其是細胞機制的重要調節劑，具有影響致癌過程的潛力。

2 lncRNA在腎癌中的機制

腎癌是一種異質性疾病，通常分為透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)和非透明細胞腎細胞癌(non clear cell renal cell carcinoma，nccRCC)，前者占腎細胞癌的75%以上，其次是腎乳頭狀細胞癌、腎嫌色細胞癌和其他腎細胞癌亞型[17]。編碼林道綜合征(Von Hippel-Lindau，VHL)的VHL基因突變或缺失失活導致的缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)途徑激活以及增殖和血管生成的誘導是ccRCC的驅動因素[18]，且靶向HIF激活誘導的血管內皮生長因子依賴性血管生成一直是系統治療的基礎[17]。ccRCC中其他常見的致癌機制包括染色質重塑基因的改變，如乳腺癌1型相關蛋白1(breast cancer 1-associated protein 1，BAP1)、染色質重塑因子相關因子1(polybromo-1，PBRM1)和含SET結構域蛋白2(SET domain-containing protein 2，SETD2)[19-20]，雷帕霉素途徑靶點的激活和TP53的改變。大約2 000 個lncRNA在腎細胞癌中存在異常表達[21]，這些lncRNA在ccRCC中具有特征性，被認為在HIF途徑的激活中具有重要作用，并參與多種致癌機制。

2.1依賴HIF途徑調控 lncRNA在HIF途經中起著至關重要的作用，包括H19、肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1)、HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)和lncRNA-腎細胞癌雄激素抑制受體(suppressing androgen receptor in renal cell carcinoma，SARCC)。

H19是一種來自第11號染色體上母系印跡基因簇的lncRNA，H19的表達由膠質母細胞瘤細胞系中HIF-1α通路激活引發[22]。研究者對H19在ccRCC中的作用產生極大興趣，但在ccRCC中HIF途徑被上調。與正常腎組織相比，H19在ccRCC中上調[23]，且H19可能在ccRCC細胞中作為ceRNA起作用，以防止E2F1(一種促進細胞增殖的轉錄因子)的降解[24]。其他實體腫瘤的報道顯示，H19與許多轉錄調節因子相互作用并促進參與上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)基因的表達，使H19成為惡性腫瘤的潛在治療靶點[25]。

MALAT在ccRCC中過表達，且通過ccRCC與癌基因EZH2的相互作用在EMT的調節中起重要作用[26]。據報道，在ccRCC的背景下這種相互作用促進上皮鈣黏蛋白下調和β聯蛋白上調，這是與EMT相關的關鍵變化[27]。MALAT1還可作為ceRNA促進ccRCC細胞中的EMT，阻止miRNA介導的上皮鈣黏蛋白的E盒結合鋅指蛋白2轉錄物的降解[12]。關于轉錄調控機制，MALAT1被ccRCC中的轉錄因子FOS(一種原癌基因)上調，其激活依賴于HIF途徑[27]。

HOTAIR在ccRCC細胞中顯著過表達，且與ccRCC進展相關[28]。HOTAIR的致癌潛力取決于表觀遺傳重編程，通過與PRC2亞基的相互作用介導，人類HOX轉錄組的研究證明了這一點[29]。值得注意的是，HOTAIR還可能作為ceRNA促進ccRCC細胞系中HIF-1α的表達[30]。在類似的模型中，HOTAIR的過表達也與胰島素樣生長因子結合蛋白2的上調相關，從而促進增殖[31]。此外，雌激素受體β已被證明是ccRCC中HOTAIR表達的正向調節劑，是潛在的治療靶點[32]。

lncRNA-SARCC是ccRCC中重要的多效性lncRNA。在VHL喪失驅動的ccRCC中，lncRNA-SARCC通過結合和去穩定雄激素受體(HIF途徑的轉錄靶標)而發揮腫瘤抑制作用[33]。相反，lncRNA-SARCC在VHL野生型ccRCC腫瘤中具有致癌性，但其潛在機制尚不清楚[33]。此外，lncRNA-SARCC本身受HIF-2α調節，可與位于lncRNA-SARCC啟動子中的缺氧反應元件結合[33]。

因此，腫瘤相關的lncRNA深入參與HIF途徑的激活和調控，被認為是獲得腎癌標志的關鍵輔因子，其中影響最顯著的是血管生成途徑。

2.2不依賴于HIF途徑調控 lncARSR(一種與肝癌和腎癌相關的蛋白激酶B信號通路的lncRNA調節因子)與轉錄因子Yes相關蛋白1(Yes associated protein 1，YAP1)結合，促進YAP1依賴的轉錄程序，從而促進腎癌的侵襲和轉移擴散[34]。由于YAP1促進lncARSR的表達，lncARSR和YAP1均可形成正反饋回路[34]。此外，lncARSR可以作為ceRNA促使受體酪氨酸激酶AXL和MET(一種基因)表達，從而促進增殖和血管生成；lncARSR能夠通過外泌體運輸傳遞到鄰近細胞，并以旁分泌的方式執行生物學功能[35]。

此外，還有一些其他lncRNA不依賴HIF途徑調控。細胞骨架調節子RNA與多個轉錄調節因子結合，抑制p16基因又稱多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1，MTS1)轉錄，促進細胞周期激活[36]。lncRNA-SRLR(一種腎細胞癌相關的介導索拉非尼耐藥的lncRNA)與細胞質復合核因子κB結合，促進其核易位，導致白細胞介素(interleukin，IL)-6的后續表達，從而激活IL-6信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的正反饋自分泌環，可促進炎癥以及腫瘤的增殖和擴散[37]。SLINKY(一種腎癌中的生存預測性lncRNA)已被證明直接與異核核糖核蛋白K結合，后者可調節前者mRNA的加工過程，表明SLINKY是ccRCC細胞系中重要的轉錄調節因子[38]。MFI2-AS1(MELTF反義RNA1)在侵襲性ccRCC腫瘤中過表達，其表達與免疫應答基因的表達相關，提示MFI2-AS1可能影響腫瘤的免疫環境[39]。

另外，與正常腎組織相比，還有多種lncRNA被下調，如生長阻滯特異性轉錄因子5和母源性印跡基因3是兩個重要的促凋亡性lncRNA，它們在包括腎細胞癌在內的實體瘤中促進p53依賴性和p53非依賴性凋亡[40-42]。lncRNA細胞黏附分子1-AS1位于編碼細胞黏附分子1的基因附近，其作為腫瘤抑制因子起作用，并在ccRCC中正調節其表達[43]。神經母細胞瘤相關轉錄本1的下調與ccRCC的不良結局及其侵襲性臨床病理特征相關[44]。

其他一些lncRNA的作用尚待研究。HIF1A反義RNA 1(HIF 1 alpha-antisense RNA 1,HIF1A-AS1)和HIF1A-AS2是位于HIF1A基因3′和5′端的反義lncRNA，其在ccRCC中轉錄較正常腎組織有所增加。但是，它們在ccRCC中的作用仍不清楚。研究證明，HIF1A-AS1在ccRCC核周區堆積暗示了其在核販運中的假想作用[45]。在結腸癌細胞系模型中HIF1A-AS1的表達也顯示，它由轉錄應激觸發，并與HIF1A轉錄水平呈負相關，表明HIF1A-AS1在這種情況下可能對HIF1A的表達起調節作用[46]。在多種實體瘤模型中，HIF1A-AS2被證明是一種致癌基因，其中HIF1A-AS2的表達可促進癌細胞的增殖并增強其活性，可能與不良預后相關[47]。

關于lncRNA在ccRCC表觀遺傳調控中的潛在影響知之甚少。但是，ccRCC通常由染色質重塑基因的改變驅動，這種改變可以改變整體轉錄組的格局，并且通常已知lncRNA失調會影響多個基因的轉錄。因此，了解lncRNA表達與染色質重塑基因(如PBRM1、BAP1和SETD2)改變之間的相互作用可能對ccRCC轉錄組調控網絡的研究有重要意義。

3 lncRNA與腎癌的診斷與治療

由于lncRNA可以在幾種體液中檢測到并可以抵抗核糖核酸酶介導的降解，因此它們可能有希望成為用于篩查腎癌的生物標志物。一項基于檢測血清中5種lncRNA的方法用于診斷腎細胞癌已被提出，這5種lncRNA分別為NPTN內含子轉錄本1、Pvt1致癌基因、CDKN1A反義DNA損傷激活RNA的啟動子、磷酸酶及張力蛋白同源物假基因1和LINC00963。這種lncRNA檢測方式提供了高靈敏度和特異度，可將ccRCC患者與健康個體區分開[48]。以后需要進一步驗證將該工具整合到臨床實踐中，這可能有助于腎細胞癌的早期診斷和分型。

由于lncRNA參與多種致癌機制，因此其可能與抗腫瘤治療的耐藥性相關。抗血管生成劑是腎癌治療的基礎，但對這些藥物的耐藥性可通過lncRNA，尤其是lncARSR和lncRNA-SRLR介導。在細胞系模型中，lncARSR已顯示出通過上調AXL和MET來增強對表皮生長因子受體、酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼的耐藥性，特別是通過競爭性結合其各自的阻遏物miR-34和miR-449[35]。值得注意的是，外泌體的運輸導致了具有生物活性的lncARSR的擴散，因此在腫瘤微環境中鄰近細胞表現出對舒尼替尼的耐藥性。

已發現lncRNA-SRLR可通過先前描述的機制，增強對血管內皮生長因子受體 TKI索拉非尼的耐藥性，這些機制涉及lncRNA-SRLR直接結合核因子κB，并隨后激活ccRCC細胞系中IL-6受體-STAT3自分泌環。然而在該自分泌環中，IL-6引起的STAT3磷酸化由IL-6受體和表皮生長因子受體共同介導。這種共激活導致對IL-6信號的細胞質調節劑不敏感，后者僅通過IL-6受體起作用[49]。該機制可能促進導致索拉非尼耐藥的表型，因此lncARSR和lncRNA-SRLR的研究可能為克服腎癌抗血管生成療法的耐藥性提供幫助。

此外，靶向lncRNA的另一種方法是使用反義寡核苷酸干擾RNA。這些寡核苷酸能夠識別lncRNA的序列，阻斷lncRNA與其靶標的相互作用，還可通過核糖核酸酶H或RNA誘導的沉默復合物的識別，加工誘導lncRNA的降解[50]。然而，關于用該方法靶向lncRNA的挑戰仍然很多。值得注意的是，準確的體內遞送很重要，各種遞送方法正在開發中，以將治療性寡核苷酸攜帶到癌細胞的細胞質中為主，包括病毒載體、多聚體(基于聚合物包衣)和脂質復合物(基于陽離子脂質體)[51-52]。這些方法可以保護干擾RNA免于細胞外降解，并且有助于進入細胞質。局部給藥可確保藥物的遞送效率，且副作用少，如其他基于病毒的治療方法(黑色素瘤中的溶瘤免疫治療方案)[53]。但是，在多系統腫瘤并存的情況下，藥物需要全身遞送，這時應評估每種癌癥亞型的正常組織和腫瘤分布。此外，在以后的早期臨床試驗中，使用這些方法時應仔細監測不良事件，其主要原因為lncRNA及其網絡具有廣泛的生物學功能，但目前對其研究尚不清楚，可能會導致意外的不良事件。

4 小 結

鑒于lncRNA參與多種致癌機制，lncRNA的研究將是提高臨床對腎癌生物學的理解和對腎癌進行早期診斷的關鍵。此外，針對lncRNA的靶向分子藥物可能是一種有前景的新型腎癌治療方法。然而，關于lncRNA致癌機制的可用信息在腎癌中仍然較分散，如果調節機制受到細胞環境的影響，這可能是一個問題。lncRNA表達的腫瘤內異質性也是未知的，可能影響腫瘤亞克隆的行為。腎癌中lncRNA的生物標志物研究為其在臨床實踐中的實施奠定了基礎。現在需要對這些基于lncRNA的研究進行驗證，并根據前瞻性試驗的結果來衡量其臨床相關性。因此，lncRNA是有前途但具有挑戰性的工具，可以深遠影響腎癌的管理。將lncRNA實施到常規臨床實踐中，能為精準醫療的發展提供幫助。