漳州部分豬場PCV-2血清學調查

黃朝勇 漳州市龍文區農業農村局 福建漳州 363000

PCV-2是豬圓環病毒?。≒orcine circovirus diseases，PCVD/PCVAD）、仔豬斷乳綜合癥（PMWS）、豬繁殖障礙、豬呼吸系統綜合征等疾病的主要病原體之一[1]。有報道表明，PCV-2在豬的免疫細胞內復制可引發免疫細胞凋亡，導致機體免疫能力受阻，造成機體抵抗能力減弱。其他病毒或細菌，在這個時候入侵機體，形成混合感染，或造成繼發感染，進而造成豬的死亡[2]。

PCV-2為無囊膜的單股環狀DNA病毒，由衣殼蛋白和核酸構成，是目前最小的動物病毒之一。PCV-2的天然宿主是豬，對豬具有極強的感染性，但在其他動物體內檢測不到該病毒的抗體[3]。

2000年，郎洪武等首次報道了我國也存在豬圓環病毒 2 型（Pig round ring disease type 2，PCV-2）[4]。2005年，郭站軍等對福州市發病豬群病料進行PCR檢測，結果證實福州養豬場存在PCV-2感染，而且普遍。有報道指出，PCV-2在中國豬群中廣泛存在，給中國養豬業帶來了嚴重的經濟損失[5]。

目前豬場主要通過全病毒滅活苗和亞單位疫苗進行免疫，其中主要是使用亞單位疫苗[6]。由于亞單位疫苗均是選用Cap蛋白作為抗原，因此，利用非Cap蛋白包被的ELISA進行的抗體檢測，可以有效地區分野毒感染；而以Cap蛋白包被的間接ELISA進行的抗體檢測則可以反映疫苗的免疫情況。因此，本研究利用基于PCV-2的非結構蛋白ORF3蛋白作為抗原的間接ELISA和購買的以Cap蛋白包被的間接ELISA方法對漳州市已經用PCV-2亞單位疫苗免疫的部分規模豬場進行血清學調查，以了解PCV-2流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料 抗原（ORF3原核表達蛋白）、酶標板、待檢血清、酶標二抗（羊抗兔）、包被液、終止液（2 mol/L硫酸溶液）、洗滌液、封閉液（含5%BSA的PBST緩沖液）、鄰苯二胺（OPD）等?；贑ap蛋白的間接ELISA試劑盒。

1.2 儀器 超凈工作臺、微量移液器、酶標儀等。

1.3 血清 從漳州部分豬場收集的已采用PCV-2亞單位疫苗免疫的血清250份。

1.4 基于ORF3的間接ELISA方法

1.4.1 包被抗原 用包被液1:40倍稀釋PCV-2 ORF3抗原，加入酶標板，每孔100 μL，置于4℃冰箱包被過夜。

1.4.2 封閉 倒掉包被液，并于干凈的紗布上拍干，用含有吐溫的PBS緩沖液洗滌，共洗滌3次，3 min/次。 分別加入 200 μL封閉液/孔 （含 0.05%BSA的PBST緩沖液），在濕盒內，37℃條件下封閉3 h；然后用含有吐溫的PBS緩沖液洗滌，共洗3次，3 min/次，拍干。

1.4.3 加待檢血清 以1:4 000倍稀釋待檢血清，分別加入100 μL/孔，放置濕盒內，37℃條件下孵育2 h；然后用含有吐溫的PBS緩沖液洗滌，共洗3次，3 min/次，拍干。

1.4.4 加二抗 在每孔中分別加入以1:5 000倍稀釋的羊抗兔溶液200 μL，放置濕盒內，37℃條件下儲存2 h；然后用含有吐溫的PBS緩沖液洗滌，洗3 次，3 min/次，拍干。

1.4.5 終止反應 取10 mL檸檬酸鈉緩沖液，加OPD和3%雙氧化氫溶液100 μL，置濕盒37℃避光顯色10 min后加2 mol/L終止液100 μL，終止反應。

酶標儀檢測：選擇波長A490 nm，以空白孔調零，當P/W≧2.1時，判定為陽性。

1.5 基于Cap的間接ELISA方法 按說明書進行。

2 結果與分析

試驗共檢測了漳州市部分規?；i場送檢的250份血清，使用Cap蛋白作為包被抗原測得陽性230份，陽性率92%；使用ORF3蛋白作為包被抗原測得陽性130份，陽性率52%（見表1）?？梢?，漳州市豬場雖然有進行PCV-2亞單位疫苗免疫，但是仍然存在PCV-2野毒感染較高的情況。

表1 抗體檢測結果

3 討 論

第一個有記載的PCV-2病例是1991年。1998年，Allan分離出PCV-2病毒。之后，Meehan等確定了PCV-2的全部基因序列[7]。再后來是PCV-2感染與其他細菌或病毒性疾病的混合感染相繼出現。郎洪武等研究人員利用ELISA技術，對我國7個省（市）的500多頭豬進行了20多次血清檢測，結果顯示血清陽性率為42.9%，表明PCV-2在我國各地都有流行。曹勝波等研究表明PCV-2在中國養豬場廣泛存在。

有研究表明，PCV-2可破壞免疫細胞，造成免疫應答能力減弱，可能會導致其他病毒或者細菌混合感染和繼發感染，從而給養豬業帶來了巨大的經濟損失[8]。繼豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）后，PCV-2已被列為世界豬業第二大病毒病。國內多個省份對PCV-2區域流行病學方面先后進行了系統分析，福建省的福州、泉州都有相關報道。

疫苗免疫仍然是防控PCV-2的最好方法。目前市場上的PCV-2疫苗主要有全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗2種。使用亞單位疫苗免疫，可以通過采用另外一種蛋白來檢測是否存在野毒感染，具有獨特的優勢。因此，本研究選擇PCV-2亞單位疫苗免疫的豬作為研究對象，并采用ORF3蛋白作為間接ELISA的包被抗原對所收集的樣品進行檢測，獲得PCV-2野毒感染的相關數據。

對漳州市部分豬場已免疫PCV-2亞單位疫苗的豬進行血清學調查，發現經PCV-2亞單位疫苗免疫后，抗體陽性率較高，但是同時也發現部分豬只仍然存在帶毒或曾被野毒感染現象，這種感染是在疫苗免疫前感染還是疫苗免疫后感染的，有待進一步研究。本研究為今后有效防控PCV-2具有一定的參考意義。