豬小腸抗菌肽對小鼠遲發型變態反應的影響試驗

劉小龍 賴隆永 馬紹偉 陳盛勇 葉盛聰 徐 磊 楊 慧 余勛信

(1.派生特(福州)生物科技有限公司 福州 350500；2.福建農業職業技術學院 福州 350303)

抗菌肽又稱宿主防御肽，可以從動物、植物、微生物中獲得，有研究者利用乙酸浸提法從豬小腸中成功地提取到抗菌肽類物質[1-3]。抗菌肽不僅可以由嗜中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞產生，而且在黏膜和皮膚的上皮細胞、枝狀細胞和角蛋白細胞中也可以產生。可以為組成型表達，也可以由前炎癥因子和體外病原誘導產生[4]。

遲發型變態反應（Delayed type hypersensitivity，DTh），屬Ⅳ型細胞介導的遲發型變態反應，根據其機理，利用一些小分子半抗原類物質使動物體致敏，致敏后讓動物體再次接觸這類抗原，一段時間后引發動物體局部的變態反應。二硝基氟苯（2,4-dinitro-1-fluorobenzene，DNFB）是一種半抗原，將其涂抹腹壁皮膚致敏后，4～7 d后再將其涂抹于耳部，使局部產生遲發型變態反應。

本研究通過小鼠遲發型變態反應試驗，反映豬小腸抗菌肽的藥理活性，以期了解豬小腸抗菌肽對細胞免疫水平的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 健康昆明小鼠，體重（20±2）g，雌、雄各半，由福建醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑儀器 二硝基氟苯（DNFB）、麻油、生理鹽水、丙酮（均為國藥集團化學試劑有限公司）；豬小腸抗菌肽（多肽含量為0.7 mg/mL）由派生特（福州）生物科技有限公司提供；JA2603B型電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）。

1.3 溶液配制 1%DNFB溶液配制：稱定50 mg DNFB，置于潔凈的干燥小瓶中，將預先配好的5 mL丙酮麻油溶液（丙酮∶麻油＝1∶1）倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封，混勻后，用注射器通過瓶蓋取用。

1.4 試驗方法

1.4.1 豬小腸抗菌肽稀釋 取豬小腸抗菌肽 （多肽含量為0.7 mg/mL），用生理鹽水稀釋成質量濃度為0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL 的豬小腸抗菌肽注射液。

1.4.2 試驗分組與設計 將30只健康昆明小鼠隨機分成5組，每組6只。其中，試驗組1、2、3和4分別皮下注射濃度為 0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL及原液0.7 mg/mL豬小腸抗菌肽注射液；對照組與空白組分別皮下注射生理鹽水（見表1）。各組小鼠均每日注射一次，注射劑量按每克體重小鼠注射0.01 mL計算，連續注射7 d。

連續注射7 d后將小鼠腹部皮膚脫毛，范圍約3 cm×3 cm，試驗組和對照組均用1%DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏，而空白組不做任何處理。致敏5 d后，試驗組、對照組及空白組均用1%DNFB溶液10 μL均勻涂抹于所有小鼠的右耳 （兩面），24 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左、右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱量重量。直徑8 mm的左右耳片重量之差 （腫脹度）表示遲發型變態反應的程度，即：腫脹度＝右耳片重量（mg）-左耳片重量（mg）。

1.4.3 數據統計與分析 使用統計軟件對數據進行單因子方差分析，用LSD法進行多重比較，結果采用平均值±標準差表示。P＜0.05表示差異顯著。

2 結 果

由表 2 可知，試驗組 1、2、3、4，對照組和空白組腫 脹 度 分 別 為 9.4 mg、9.6 mg、10.1 mg、10.1 mg、7.8 mg、0.7 mg。試驗組 1、2、3、4 腫脹度分別與對照組和空白組差異顯著（P＜0.05）；對照組腫脹度與空白組差異顯著（P＜0.05）；試驗組 1、2、3、4 組間差異不顯著（P＞0.05）；由此表明，豬小腸抗菌肽對小鼠遲發型變態反應具有增強作用，說明豬小腸抗菌肽能夠增強機體的免疫應答水平。

表1 試驗設計

表2 豬小腸抗菌肽注射液對小鼠遲發型變態反應的影響

3 討 論

抗菌肽是生物在長期進化過程中為適應環境、求得生存而最早產生的免疫活性分子，具有選擇性效應和分子質量小、無抗原性等特點，被認為是天然免疫的重要介質，在宿主對抗病原入侵的免疫防御中起著極其重要的作用[5]。大量研究結果證明，作為宿主防御系統的重要組成成分，活性肽在體內除了能以直接殺死病原菌的方式起作用外，更多的時候是作為免疫效應分子來啟動、調節宿主免疫防御體系，從而促進免疫功能來消除感染，保護宿主免受病原微生物侵害[6-8]。在遲發型變態反應中，接觸性遲發型變態反應是由體外的一些小分子半抗原類物質如油漆、重金屬、化妝品等引發的過敏現象，這類半抗原類物質進入機體后與體內蛋白質結合成完全抗原，由朗格汗斯細胞提呈給T細胞，使T細胞激活成效應T細胞，再次接觸這類抗原時出現過敏現象。 試驗組 1、2、3、4 小鼠腫脹度 （9.0 mg、9.5 mg、10.1 mg、10.1 mg）均顯著（P＜0.05）高于對照組（7.8 mg）和空白組（0.7 mg），不同濃度的豬小腸抗菌肽對小鼠耳腫脹度也有一定程度的影響。目前，將豬小腸抗菌肽應用到動物身上的研究甚少，而豬小腸抗菌肽是否有可以增強動物疫苗的使用效果，相關研究還在繼續進行。

4 結 論

豬小腸抗菌肽注射液能顯著增強小鼠的遲發型變態反應，說明豬小腸抗菌肽能夠提高機體的細胞免疫水平。比較而言，濃度為0.3 mg/mL和0.7 mg/mL比濃度為0.1 mg/mL和0.2 mg/mL的豬小腸抗菌肽更能夠增強小鼠遲發型變態反應。