兩種禽流感病毒含量測定方法的比較

王玉玲 賴道華 黃金妹 韋姜玲 福州大北農生物技術有限公司 福州 350014

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是嚴重危害家禽和野禽的一種烈性傳染病病原，有可能引起全球流感大流行，是威脅我國養禽業的最重要疫病之一。目前，疫苗免疫是降低發病率和病死率的最主要方法，在常規的禽流感疫苗生產過程中，雞胚是禽流感病毒最為常用的一種培養基質，但用雞胚尿囊液制備抗原過程中，禽流感病毒易引起抗原性變異；大規模生產時還存在雞胚數量不足和潛在外源病毒污染的問題，尤其在禽流感暴發時。因此，為了克服這些局限和不足，急需利用哺乳動物細胞為基質制備的疫苗，這樣的疫苗具有無外源因子污染、易于規?；a、可以較好維持病毒抗原穩定等特點。目前，我國對于禽流感病毒的效價測定方法有雞胚培養法和細胞培養法，本試驗即針對兩種方法進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF蛋購自濟南斯帕法斯公司，MDCK細胞購自Invitrogen公司，3批禽流感H9N2株抗原均由福州大北農生物技術有限公司生產，DMEM購自GIBCO公司，胰酶購自Difco公司。

1.2 方法

1.2.1 雞胚培養法

1.2.1.1 樣品處理 將待測樣品用生理鹽水按10倍倍比稀釋至10-9，備用。

1.2.1.2 樣品接種 將稀釋好的10-5~10-9樣品接種10日齡SPF雞胚，5枚/稀釋度，設對照雞胚5枚。

1.2.1.3 雞胚培養及觀察 將接種組及對照組雞胚置于培養箱中培養，24 h開始照蛋，觀察雞胚死亡情況，每日2次，48 h后每6 h照蛋一次，直至120 h。期間將死胚取出并記錄死亡時間后置于2~8℃冰箱保存，120 h后測定血凝價。

1.2.1.4 血凝價（HA）測定 取全部接種胚，按照樣品及稀釋度排列，進行HA測定，血凝價≥1:16判定為陽性，計算結果。

1.2.2 細胞培養法

1.2.2.1 洗細胞板 將長滿MDCK細胞的培養板中的細胞培養液棄去，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌3次。

1.2.2.2 加液 在細胞培養板上設樣品組和對照組，樣品組每孔加入 0.1 mL、pH 7.4含胰酶的DMEM培養液，對照組每孔加入0.2 mL、pH 7.4含胰酶的DMEM培養液，DMEM培養液中胰酶的質量濃度為50 μg/mL；然后將細胞培養板置于33℃環境中孵育15 min。

1.2.2.3 樣品處理 將待測樣品用pH 7.4含50 μg/mL胰酶的DMEM培養液進行10倍倍比稀釋至 10-9，備用。

1.2.2.4 接毒 取上述稀釋度10-5~10-9的樣品液接種細胞，8孔/稀釋度，每孔0.1 mL。

1.2.2.5 培養 將接種后的細胞培養板置于33℃、5%CO2濃度的培養箱中培養120 h。

1.2.2.6 計算病毒效價 觀察細胞培養板中的細胞病變情況，使用Reed-Muench方法計算TCID50值，計算病毒效價；細胞病變的判定方法為，當細胞孔內100%細胞發生病變判定為有病毒感染，計入細胞發生CPE數。

2 結果與分析

2.1 細胞培養法不同培養時間病毒含量測定結果從表1可以看出，病毒接種細胞后72 h，基本可以得出效價結果，直至120 h沒有明顯改變。

2.2 不同培養方法測定病毒含量結果 從表2可以看出，雞胚培養法和細胞培養法得出的病毒含量結果差別不是很明顯，并且針對細胞培養法接種孔進行HA測定，發現與通過觀察細胞病變結果基本一致。

表2 兩種培養方法病毒含量測定結果

從兩種測定方法對比試驗結果可以看出，禽流感病毒效價測定方法中細胞培養法較雞胚培養法具有以下優勢：（1）省時。細胞培養法可在接種后72 h，基本可以得出結果，而雞胚培養法必須再培養120 h后才能進行血凝法測定病毒效價，因此，細胞培養法較雞胚培養法更省時。（2）省力。細胞培養法測定效價過程中只需要每天觀察一次細胞病變情況即可，而雞胚培養法在接種后48 h開始需每隔6 h進行照蛋一次，及時取出死胚留待測定血凝情況，因此，細胞培養法較雞胚培養法更省人力。（3）更穩定。利用雞胚培養后測定血凝效價，計算EID50，該方法因使用雞胚而受到一定的限制，如夏季高溫長途運輸會對雞胚質量造成一定的影響，雞胚中可能存在外源性病原污染等，這些都會導致效價測定結果不穩定或不準確，而細胞培養法因使用的是細胞，穩定性、均一性都較雞胚更佳，所以，效價測定的結果也會更穩定。（4）更準確。從比較試驗結果可以看出，觀察CPE計算的TCID50與進行血凝測定計算的EID50相比，無明顯差異，并且操作上更為簡便，更重要的是，該方法避免了不同實驗員因操作熟練度及血凝情況判定所造成的人為誤差。

因此，細胞培養法與雞胚培養法比較，在禽流感病毒的效價測定方面具有更準確、更穩定、更高效的優勢。