不同樹齡梁平柚果皮精油揮發性成分的差異分析

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(1.重慶市中藥研究院,重慶 400065;2.重慶市中藥健康學重點實驗室,重慶 400065)

梁平柚又名梁山柚,屬于文旦柚的一種,清乾隆末期由福建省引入,在重慶梁平已有200多年栽培歷史。梁平柚果高肩平頂,果形美觀,色澤橙黃,皮薄光滑,油胞較細,果皮芳香濃郁,是中國柚類平頂型柚的代表品種[1]。梁平柚果皮約占柚子鮮重的五分之一,其中外果皮約占柚子鮮重的9%,富含芳香性揮發性成分。與其它柚皮精油相似,梁平柚果皮精油不但具有柑橘類水果的芳香味,還擁有獨特的柚香味,具有祛痰、止咳、促進消化、鎮痛、抗菌消炎等作用[2-4],作為一種天然香料廣泛應用于食品、藥品和化妝品等行業。

國內外學者對柚皮精油進行了深入研究,其中一些研究表明不同產區、不同品種和不同提取方法制備的柚皮精油在品質方面存在一定的差異。洪鵬等[5]采用GC-MS法對琯溪蜜柚、沙田柚和梁平柚三種柚皮精油對比研究發現:三種柚子精油的主要成分均為d-檸檬烯(476.150～741.595 μg/mL)、β-月桂烯(13.859～207.255 μg/mL),但琯溪蜜柚精油含有更高濃度的β-月桂烯,沉香醇以及醛類成分;張浩等[6]以沙田柚為研究對象,研究采用冷壓榨、水蒸汽蒸餾及機械磨皮三種方法制備的柚皮精油揮發性成分差異性,研究發現:冷榨油的萜烯類、醛類、酯類組分的相對含量高于水提油和磨皮油,冷壓油對柚皮精油的呈香成分保留率更高;原鮮玲等[7]對廣西容縣、廣西桂林、廣西融水和福建4地沙田柚柚皮揮發性成分進行檢測,發現不同產地柚果皮揮發油中有7個共有成分,但各成分含量在不同產地的柚果皮揮發油中有一定差別。經多年田間觀察發現,在梁平柚主產區同一果園內不同樹齡柚皮精油的感官評價存在明顯差異性,但目前關于樹齡對梁平柚果皮精油揮發性成分組成影響的研究鮮見報道。

本研究以不同樹齡梁平柚果皮精油為研究對象,采用頂空固相微萃取法(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)萃取柚皮精油揮發性成分,結合氣相色譜質譜聯用法(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)分析其組成,并運用偏最小二乘法判別法(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和凝聚層級聚類法(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)兩種統計分析方法對其進行組分差異分析,以期為梁平柚果皮精油差異化開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試的梁平柚果 均來自重慶市梁平區合興鎮龍灘村萬畝名柚園,分別選取土壤類型、地勢地貌、管理水平及樹冠內密度等基本一致,樹齡分別為7～10、11～15、16～20、21～30和30年以上的梁平柚樹,每個樹齡隨機挑選10棵樹,分別從每棵樹中間冠層外圍采集1個果實,每個樹齡采集10個,所選果實大小一致、無病害且成熟度相似。依次將5個樹齡段柚果設為N1、N2、N3、N4、N5組,每組10個樣品,分別為1～10號樣為N1組,11～20號樣為N2組,21～30號樣為N3組,31～40號樣為N4組,41～50號樣為N5組。果實無損運回實驗室后,于4 ℃保存至使用;正構烷烴標準品(C6～C20) 美國Sigma公司;氯化鈉(分析純) 重慶川東化工(集團)有限公司。

Agilent TD-GC/MS(7890A-5975C)型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司;57330-U SPME手柄、75 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取纖維頭 美國SUPELCO公司;頂空萃取瓶 濟南賽暢科學儀器有限公司;HJ-A4型數顯恒溫攪拌水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取樣品制備 將剔去白皮層的柚皮切成2 mm的方塊,準確稱取0.5 g,置于20 mL頂空萃取瓶中,加入3 mL純水,于高速分散器中處理2 min,加入1.05 g NaCl固體(形成NaCl飽和溶液),用聚四氟乙烯隔墊密封,于80 ℃水浴中平衡20 min后。將萃取頭插入250 ℃的GC進樣口老化20 min,然后插入經過平衡的裝有樣品的頂空萃取瓶中,于80 ℃下吸附40 min;再將萃取頭插入GC進樣口,250 ℃解吸5 min。

1.2.2 GC-MS分析條件 色譜條件:色譜柱為RTX-5MS毛細管柱(60 m×0.32 mm×0.25μm);載氣為He,流速1 mL/min,分離比5∶1;進樣溫度為250 ℃;升溫程序為起始溫度為40 ℃,保持5 min,以8 ℃/min,升至250 ℃,保持5 min。

質譜條件:EI電離源,能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,接口溫度250 ℃,掃描范圍30～500 m/z。

1.3 數據處理

柚皮精油揮發性物質利用GC-MS 聯用儀進行鑒定,并根據C6～C20正構烷烴的保留時間計算各個色譜峰的保留指數,利用NIST08標準譜庫進行初步檢索,選取相似度大于80%的揮發性成分,并結合相關文獻[8-13]的保留指數對比進行定性分析,通過色譜峰面積歸一化法計算得各揮發性成分在不同樣品精油中的相對含量;應用Excel 2007進行數據收集和整理,利用SIMCA-P 14.0對5種不同樹齡梁平柚果皮精油中的揮發性成分進行PLS-DA和HCA分析。

2 結果與討論

2.1 不同樹齡梁平柚皮揮發性成分分析

通過GC-MS檢測分析,得到5種不同樹齡梁平柚果皮精油揮發性成分的總離子流色譜圖,由圖1可知,本試驗所使用的GC-MS條件能較好分離各揮發性成分,其差異主要出現在檢測時的5～30 min時間段。

圖1 不同樹齡梁平柚果皮精油 揮發性成分縱向疊加總離子流色譜圖Fig.1 Overlapped total ion current chromatograms of volatile components in peel of Liangping pomelo with different tree ages

5種不同樹齡梁平柚果皮精油中共分離檢測到72種揮發性化學成分,利用質譜信息與標準譜庫NIST08分別對各色譜峰進行初步檢索及相關文獻參考定性,確認揮發性物質名稱,其分析結果見表1。如表1所示,5種不同樹齡梁平柚果皮精油的揮發性成分中有8種成分較高(相對含量>1%),分別為d-檸檬烯(49.93%～54.93%)、β-月桂烯(18.55%～20.79%)、大根香葉烯 D(2.16%～3.66%)、檜烯(1.53%～3.20%)、β-蒎烯(1.33%～2.80%)、檸檬醛(2.52%～2.73%)、E-β-羅勒烯(1.49%～2.46%)、圓柚酮(1.01%～2.14%),共占總揮發性成分的83.40%～87.61%。本試驗檢測出的d-檸檬烯和β-月桂烯相對含量與洪鵬等[5]的研究結果具有較大差異,洪鵬等通過擠壓法制備的梁平柚精油揮發性成分中d-檸檬烯為74.16%和β-月桂烯為13.86%,這種差異可能來源于實驗柚果成熟度的差異或柚皮精油制備工藝的不同[14]。

表1 不同樹齡梁平柚果皮揮發性成分及相對含量Table 1 Volatile components and relative contents in peel of Liangping pomelo with different tree ages

續表

注:“-”為參考文獻[8-13]中未報道,同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

相關研究表明[15-17],柚皮精油的揮發性成分中d-檸檬烯、β-月桂烯、圓柚酮、α-蒎烯、β-蒎烯和芳樟醇為其主要香味成分。由表1可以看出,d-檸檬烯在不同樹齡梁平柚果皮精油中的相對含量較穩定,無顯著差異性(P>0.05);N5組β-月桂烯相對含量(20.79%)顯著大于N1組(18.55%)(P<0.05),N2、N3和N4組無顯著差異(P>0.05),表明樹齡越大,柚皮的香甜脂氣味[18]越濃;圓柚酮能提供強烈的柚子橙子果香味[5],N4組中圓柚酮相對含量最高(2.14%),與其他測試組差異顯著(P<0.05);α-蒎烯和β-蒎烯具有松節油香味[3],在N1組中相對含量最高,分別為2.50%和2.80%,2種成分的相對含量隨樹齡的增長,均呈逐漸減少趨勢;芳樟醇具有花香、果香和濃郁草香味[3],在N1組中相對含量最高(2.22%),隨樹齡的增長其逐漸減少。

同時由表1可以看出,隨著樹齡的增長,柚皮精油揮發性成分中保留指數大于2000的揮發性成分相對含量逐漸增加,由N1的0.01%增長到N5的0.39%,孫浩等[9]研究發現,這類成分在常溫下難以揮發,對香氣幾乎沒有影響,但對柚皮精油的透明度和澄清度有負面影響,造成精油穩定性降低。由此可見,不同樹齡梁平柚果皮中主要揮發性成分的相對含量具有較為顯著的差異(P<0.05),這種差異性可能來源于不同樹齡梁平柚樹生理代謝能力的強弱。

進一步對檢測出的各揮發性成分進行歸類,結果(表2)表明烯烴類化合物含量、種類豐富,是構成梁平柚果香氣成分的主要物質,占總揮發性成分的85%以上;醇類、醛類、酮類化合物在揮發性成分中也占有較大比重,其相對含量均>1%。采用Duncan’s新復極差法對組間差異進行分析,N5組的醛類、酮類、酯類及酸類等化合物相對含量顯著高于N1和N2組(P<0.05),N1和N2組的醇類化合物相對含量顯著高于N4和N5組(P<0.05),5個組的烯烴類無顯著差異性(P>0.05)。

表2 各揮發性成分的種類和相對含量Table 2 Varieties and relative contents of volatile components

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

在烯烴類化合物中,N5組不含莰烯、4-蒈烯、2-辛烯、雙環[2.2.1]庚-2-烯、甘香烯、α-石竹烯等,N1組不含γ-萜品烯和p-傘花烴;(Z)-氧化芳樟醇、環戊-4-烯醇、薄荷-2,8-二烯-1-醇、(E)-2-已烯-1-醇、3-環己烯-1-醇、(E)-橙花叔醇、3,7,11-三甲基-6,10-十二烯-1-醇等醇類化合物未在N5組檢出;(Z)-己酸-3-己烯酯、甲基棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、亞麻酸等酸、酯類化合物未在N1組檢出。

結合表1和表2可以看出,在低樹齡段(7～10年),梁平柚果皮精油的揮發性成分含有較多的小分子芳香物質,如α-蒎烯、莰烯、α-水芹烯、4-蒈烯、2-辛烯、1,3,5-環庚三烯、2-辛烯等。隨著樹齡的增長,精油中芳香物質不僅在富集,還在向更穩定的化合狀態轉變,由小分子萜烯類化合物經氧化成了留香較為持久、分子量較大的酮、酯等。另外,精油中揮發性物質的相對含量隨著樹齡的增長而有不同方向和程度的變化。如α-蒎烯、莰烯、檜烯、β-蒎烯、α-水芹烯、4-蒈烯、芳樟醇、薄荷-2,8-二烯-1-醇、L-香芹醇等芳香物質隨著樹齡增長,其相對含量逐漸減少;蛇床子素、亞麻酸、9,12-十八碳二烯酸(反式亞油酸)、順式-9,12-十八碳二烯酸甲酯、正十六烷酸、甲基棕櫚酸等大分子芳香物質隨著樹齡增長,其相對含量逐漸增加。這可能是因為幼樹期,樹勢旺盛,養分供應偏向于營養生長,果實果皮厚、風味淡,隨著樹齡增大,樹勢趨于穩定,樹體養分分配趨于平衡,枝葉的新陳代謝能力也較強,因而果實趨于均勻,果皮變薄,風味變濃[19]。由此可見,在品質、產地和制備方法相同的條件下,柚皮精油的組成及揮發性成分相對含量都存在差異性。

2.2 偏最小二乘法判別分析

為進一步研究不同樹齡梁平柚皮精油揮發性成分的差異性,對其進行PLS-DA分析。PLS-DA分析法是一種集主成分分析、典型相關分析和多元回歸分析為一體的統計方法,通過降維處理將重復的變量(關系緊密的變量)刪去多余,建立盡可能少的新變量,使得這些新變量是兩兩不相關的,而且這些新變量在反映研究的信息方面盡可能保持原有的信息。

將試驗中50個樣品按不同樹齡預先分組,通過SIMCA軟件構建PLS-DA數學模型。由表3可知,PLS-DA模型包含5個主成分,前2個主成分累計方差貢獻率為69.7%,綜合了不同樹齡柚皮精油揮發性成分的大部分信息,可以較好說明該數據的變化趨勢。以不同樹齡柚皮精油揮發性成分在第1、2主成分上的得分作圖,主成分得分圖(圖2a)顯示5種不同樹齡梁平柚皮揮發性成分樣品均處于相對獨立的空間位置。在第1主成分平面上,可顯著區分(N1與N5、N2與N4、N1與N4、N2與N5、N1與N3、N3與N5)樣品,但對(N1與N2、N2與N3、N3與N4、N4與N5)樣品區分效果不明顯;在第2主成分平面上,可顯著區分(N1與N2、N2與N3、N4與N5)樣品,但對N3與N4組區分效果不明顯。載荷圖(圖2b)中各揮發性成分的分布情況與主成分得分圖中樣本點的分布位置相對應。由此可見,PLS-DA可對不同樹齡梁平柚皮精油揮發性成分進行一定的分類,說明其相對含量有著一定程度的區別。

表3 PLS-DA的特征值、貢獻率及預測能力Table 3 Eigenvalues,cumulative contribution and predication performance by PLS-DA

圖2 不同樹齡柚皮精油的主成分得分圖(a)和載荷圖(b)Fig.2 PLS-DA score plots(a)and loading plots(b)of essential oil of pomelo peel with different ages注:圖中a數字表示不同柚皮精油樣品;圖b表示不同揮發性成分。

圖3 不同柚皮精油樣品聚類樹狀圖Fig.3 Cluster dendrogram of essential oil samples from different pomelo peels

2.3 凝聚層級聚類分析

分別以50個梁平柚皮精油和72種鑒定出的揮發性成分相對含量為原始變量,進行HCA分析,使品質相近聚在一起,采用word 聚類方法,使用歐式距離來計算不同類別數據點間的距離(相似度),構建50個梁平柚皮樣品及72種揮發性成分聚類樹狀圖。由圖3可知,50個梁平柚皮樣品在標度為230時可聚類為3類,第1類包含N4組(31～40號樣)和N5組(41～50號樣)的20個樣品;第2類包含N3組(21～30號樣)合N2組(38號樣)的11個樣品;第3類包含N1組(1～10號樣)和N2組(21～27、29、30號樣)的19個樣品。由圖4可知,72種柚皮揮發性成分在標度為0.49時可聚類為3類,第1類包含檸檬醛、d-檸檬烯、β-月桂烯、圓柚酮、α-法呢烯、蛇床子素等33種揮發性成分;第2類包含α-石竹烯、β-金合歡烯、大根香葉烯 B、乙酸香茅酯等11種揮發性成分;第3類包含α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、L-薄荷醇、芳樟醇等28種揮發性成分。結合PLS-DA得分圖和載荷圖,3類梁平柚皮樣品分別位于得分圖的左、中、右方位,而3類揮發性成分分別位于載荷圖的左、中、右方位。對比圖3及圖4結果發現,HCA分析與PLS-DA分析結果存在一致性,可相互印證、互為補充。

圖4 精油揮發性成分的聚類分析圖Fig.4 Cluster dendrogram of volatile components in essential oil

2.4 不同樹齡梁平柚皮特征揮發性物質分析

結合PLS-DA的載荷圖和重要性變量因子(Variable important for the projection,VIP)值分析,可以找出區分不同樹齡柚皮精油揮發性成分的潛在標志物。VIP值可以量化每個變量因子對分類的貢獻[20],VIP值越大,揮發性成分對不同樹齡柚皮精油樣品的差異貢獻越顯著。通過計算出的VIP值(表4),發現有21個揮發性成分VIP值大于1。

表4 不同樹齡柚皮揮發性成分中潛在標志物(VIP>1)Table 4 Potential markers of volatile components in pomelo peel with different tree ages(VIP>1)

將HCA分析結果結合PLS-DA主成分得分圖和載荷圖中的VIP值(表4)可知,將3類梁平柚皮精油樣品區分開的特征揮發性成分為:乙酸香葉酯、正十六烷酸、L-紫蘇醇、蛇床子素、β-石竹烯、δ-蓽橙茄烯、β-欖香烯等7個成分為第Ⅰ類樣品的特征物。正十六烷酸、蛇床子素的油脂味[8]和乙酸香葉酯、L-紫蘇醇、β-欖香烯的草木味[17],使得這類柚皮精油具有強烈的草木油香味;(E)-2-已烯-1-醇、大根香葉烯 B、α-石竹烯、3-環己烯-1-醇、3,7,11-三甲基-6,10-十二烯-1-醇、β-金合歡烯等6個成分為第Ⅱ類樣品的特征物。這類柚皮精油因β-金合歡烯、α-石竹烯具有典型柑橘香甜味[10-11];L-薄荷醇、(Z)-香芹酮、3,4-二甲基-2-己醇等余下的8個成分為第Ⅲ類樣品的特征物,L-薄荷醇和(Z)-香芹酮使這類柚皮精油具有強烈的薄荷味。

圖5 主成分載荷圖Fig.5 Biplot of principal component analysis注:圖中“■”表示不同精油樣品,“●”表示VIP值>1的揮發性成分。

PLS-DA和HCA是兩種重要的多變量統計分析方法,將較多的變量利用降維處理為盡可能少的新變量,使得這些新變量是兩兩不相關的,同時歸納出潛在標志物,目前其廣泛用于食品、藥品和農產品等品質差異性分析及親緣鑒定識別。劉彬球等[20]利用PCA和PLS-DA分析法對不同等級的曬青毛茶多項理化成分進行統計分析,發現茶葉中的氨基酸組分含量是曬青毛茶級別分類的重要理化成分,其中賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)起著較為顯著的作用;Lota 等[21]采用PCA和HCA分析法將15種寬皮柑橘歸納為3個化學類型:檸檬烯型、檸檬烯/γ-萜品烯型和乙酸芳樟酯/檸檬烯型;Pan 等[22]利用液相紫外檢測串聯質譜研究了不同產地瑪咖的瑪咖酰胺含量差異,并根據PLS-DA模型區分了產地。本試驗運用HCA分析法將5個不同樹齡段梁平柚皮精油聚類為3類,根據特征性揮發物質可將3類精油按香型分為草木油香味(N4和N5組),典型柑橘香甜味型(N3組),濃郁薄荷香型(N1和N2組)。

3 結論

梁平柚果皮富含豐富的芳香性揮發性成分,但不同樹齡段果皮精油揮發性成分的組成具有一定差異性。在低樹齡段精油中含有較多的小分子芳香物質;隨著樹齡的增長,酮、酯等留香較為持久、分子量較大的物質逐漸增多,使不同樹齡段的柚皮精油呈現出不同的香型特征。因此,在梁平柚果皮精油的開發利用時,應根據其精油組分的變化趨勢選擇合適的加工工藝及產品類型,進行差異化開發利用。