匙羹藤酸調節倉鼠血脂機理的研究

,2,3,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.天津科技大學食品工程與生物技術學院,食品營養與安全教育部重點實驗室,天津 300457;3.天津食品安全低碳制造協同創新中心,天津 300457)

隨著我國居民生活水平的不斷提升,傳統的飲食結構發生改變,高脂、高糖和缺乏運動等不健康的生活模式導致高脂血癥及其并發癥的發病率越來越高且日益低齡化。就高膽固醇血癥而言,從2002～2012年間,我國居民的患病率就增加了4倍[1-2]。目前市場上主要用于降脂的藥物為他汀類藥物,部分高脂血癥的患者由于其副作用而無法使用他汀類藥物進行治療[3-4],另外隨著我國居民對健康意識的提高,效果好、使用更安全的可用于預防降血脂的藥食同源的天然產物更受大家的關注和青睞[5-6]。

匙羹藤(Gymnemasylvestre),蘿藦科匙羹藤屬,是一種傳統民間草藥,在印度以‘gurmar’(糖分殺手)而聞名,原產于印度中西部,也分布于非洲、澳大利亞和中國的熱帶森林中,具有降糖降脂[7-9]、控制體重[10]、抗齲齒[11]、抑菌[12-13]、免疫調節[14]等作用,被廣泛應用于食品、保健品、化妝品等行業[15-16]。匙羹藤酸是從匙羹藤中分離出來的三萜皂苷類物質混合物[17-18],具有抑制小腸對油酸的吸收[19]、抑制三磷酸甘油醛脫氫酶活性[20]、抑制蛋白質合成[21]、抑制α葡萄糖苷酶[22]、抑制鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白1活性[23]等多種生物活性,被廣泛用于治療由代謝紊亂引起的疾病,是匙羹藤降糖降脂的主要活性成分[24]。目前已經有很多的研究證明匙羹藤酸具有調節血脂功效,Renga等[17]通過體外實驗,發現匙羹藤酸I可以抑制高脂細胞內脂類的積累,但是對匙羹藤酸調節血脂活性及機理的研究鮮有報導。因此本實驗就匙羹藤酸調節高脂倉鼠血脂水平及其機制進行了研究,為匙羹藤酸調節血脂的保健品的開發提供提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

匙羹藤酸(純度75%)、倉鼠(Hamster)羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)ELISA檢測試劑盒、膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)ELISA檢測試劑盒、酰基輔酶A:膽固醇酰基轉移酶(ACAT)ELISA檢測試劑盒 上海源葉生物科技有限公司;總膽固醇(T-CHO)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒谷草轉氨酶(AST)測試盒、谷丙轉氨酶(ALT)測試盒 南京建成生物工程研究所;SPF級雄性倉鼠 40只,體重(100±10) g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,實驗動物質量合格證明編號:11401500033320,許可證號為SCXK(京)2014-0006;玉米淀粉 北京科澳協力飼料有限公司;基礎飼料和高脂飼料 均由本實驗室自制,基礎飼料配方配方為玉米淀粉(50.80%)、酪蛋白(24.20%)、白砂糖(11.90%)、豬油(5.00%)、礦物質混合物(4.00%)、維生素混合物(2.00%)、明膠(2.00%)、DL-蛋氨酸(0.10%)；高脂飼料配方為玉米淀粉(40.70%)、酪蛋白(24.20%)、白砂糖(11.90%)、豬油(15.00%)、膽固醇(0.10%)、礦物質混合物(4.00%)、維生素混合物(2.00%)、明膠(2.00%)、DL-蛋氨酸(0.10%)[25]。

Multiskan FC酶標儀 美國Thermo Fisher公司;MICRO 17R臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;ML204電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;CKX41倒置相差熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼養條件及實驗倉鼠分組 實驗倉鼠飼養于天津科技大學清潔級動物飼養房中,室內溫度為(22±2) ℃,濕度為50%～60%,12 h光照、明暗交替,并讓其自由飲食和飲水。

選用健康雄性倉鼠40只,適應性喂養一周之后根據體重進行隨機分組,分為5組,每組8只,分別為正常對照組(NC)、模型對照組(MC)、匙羹藤酸低劑量組(L)、匙羹藤酸中劑量組(M)、匙羹藤酸高劑量組(H)。

1.2.2 各個組別的灌胃方式 匙羹藤酸的灌胃方式如表1所示。

表1 各組倉鼠的灌胃方式Table 1 Gastric administration of hamsters in each group

1.2.3 樣品采集 在0、4、8周周末對各組倉鼠進行眼眶靜脈叢取血,采血前禁食不禁水12 h,在實驗周的第8周周末禁食不禁水12 h后處死,處死前稱其體重,股動脈取血,頸椎脫臼致死,快速分離肝臟、腎周脂肪、睪丸脂肪,后用生理鹽水清洗,濾紙吸干,并稱其質量。

1.2.4 指標的測定

1.2.4.1 倉鼠體重的測定 實驗周期內每天觀察倉鼠生長狀況(倉鼠的毛色、進食、排便及活動等情況),每兩周稱量1次體重。

1.2.4.2 倉鼠肝臟臟器指數和脂肪系數的測定 分離出倉鼠的肝臟、雙腎周脂肪組織和睪丸周脂肪組織,用生理鹽水清洗,濾紙吸干后,稱重量,肝臟臟器指數按式(1)計算,脂肪系數按式(2)計算。

式(1)

式(2)

1.2.4.3 倉鼠血清中血脂水平的測定 將第0、4、8周周末采集的血液樣本,25 ℃放置2 h后,3000 r/min,4 ℃離心10 min,分離血清,測定各組倉鼠血清中TG、TC和HDL-C水平,并計算出non-HDL-C水平。具體檢測方法按照南京建成生物研究所的總膽固醇(T-CHO)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒說明書進行。non-HDL-C按式(3)計算。

Cnon-HDL-C=CTC-CHDL-C

式(3)

式中，CTC、CHDL-C、Cnon-HDL-C分別表示TC、HDL-C、non-HDL-C的含量，mmol/L。

1.2.4.4 倉鼠血清中肝損傷指標的測定及肝臟切片染色觀察 將第8周周末采集的血液樣本,25 ℃放置2 h后,3000 r/min,4 ℃離心10 min,分離血清,按南京建成生物研究所的谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒、谷丙轉氨酶(ALT)檢測試劑盒測定各組倉鼠血清中AST、ALT水平;采用HE染色法,取1 mm3肝小葉立方塊[25],用4%的甲醛固定液固定、脫水、石蠟包埋、切片脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色、切片脫水,染色切片在光學顯微鏡下進行觀察和圖像分析,觀察肝臟的病理組織學變化。

1.2.4.5 倉鼠血清中膽固醇調控相關酶活的測定 將第8周股動脈采取的血樣樣本,25 ℃放置2 h后,3000 r/min離心10 min,離心后迅速分離血清,測定各組倉鼠血清中膽固醇調控相關酶HMGCR、CYP7A1、ACAT水平。具體檢測方法按照上海源葉生物科技有限公司倉鼠(Hamster)羥甲基式二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)ELISA檢測試劑盒、倉鼠(Hamster)膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)ELISA檢測試劑盒、倉鼠(Hamster)酰基輔酶A:膽固醇酰基轉移酶(ACAT)ELISA檢測試劑盒進行檢測。

1.2.4.6 倉鼠肝臟HMGCR酶活的測定 實驗倉鼠處死后迅速分離肝臟、小腸,取0.1 g肝臟組織(小腸),用冰冷的生理鹽水漂洗,除去血液,濾紙擦拭后稱取0.1 g加入勻漿器中,再加入0.9 mL冷的無菌生理鹽水于冰水浴條件下充分研磨,使組織勻漿化,隨后轉移勻漿液至1.5 mL離心管中,2000 r/min、4 ℃離心10～15 min,取適量上清液,按上海源葉生物科技有限公司的酶聯免疫試劑盒測定各組倉鼠肝臟中膽固醇調控相關酶HMGCR酶活。

1.3 數據處理

采用Origin 2017作圖,SPSS 17.0軟件進行數據統計分析,實驗數據以Mean±SD表示,多組間采用單因素方差分析,若方差齊時采用LSD檢驗,方差不齊性時采用Tamhane’s T2檢驗,P<0.05表示兩組之間具有顯著性差異,P<0.01表示兩組之間具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 匙羹藤酸對倉鼠體重的影響

在實驗周期,每兩周對實驗倉鼠的體重進行稱量一次,其體重變化見圖1。如圖1所示,灌胃前,各組倉鼠之間的體重無顯著性差異(P>0.05),隨著倉鼠鼠齡的增長,各組倉鼠體重都有所增長,但是在整個實驗期間,模型對照組與正常對照組倉鼠體重無顯著性差異(P>0.05),說明高脂飲食對倉鼠的體重均無顯著性影響(P>0.05),這與王軼菲的玉米油甾醇對高脂高膽固醇膳食倉鼠膽固醇代謝調控及腸道菌群的影響中的結果一致[26],匙羹藤酸劑量組與模型對照組倉鼠體重無顯著性差異(P>0.05),說明匙羹藤酸對倉鼠體重無顯著性影響(P>0.05)。

圖1 匙羹藤酸對倉鼠體重的影響Fig.1 Effect of gymnemic acid on the body weight of hamster

2.2 匙羹藤酸對倉鼠臟器指數和脂肪系數的影響

如表2所示,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠的肝臟的臟器指數有極顯著差異(P<0.01),說明高脂膳食會導致倉鼠肝臟腫大;正常組、模型組和劑量組的附睪脂肪系數無明顯差異，說明匙羹藤酸以及高脂飲食對附睪脂肪系數無顯著性影響，與模型對照組相比,匙羹藤酸劑量組倉鼠的肝臟的臟器指數有顯著的下降(P<0.05),下降率分別為6.12%、12.24%、17.69%,表明匙羹藤酸對高脂膳食倉鼠引起的肝臟腫大有一定的緩解作用。

表2 匙羹藤酸對倉鼠臟器指數和脂肪系數的影響Table 2 Effects of gymnemic acid on the organ index and fat index of hamster

注:#模型對照組與正常對照組比較有顯著差異,P<0.05;##模型對照組與正常對照組比較有極顯著差異,P<0.01;*匙羹藤酸劑量組與模型對照組比較有顯著差異,P<0.05;**匙羹藤酸劑量組與模型對照組比較有極顯著差異,P<0.01;圖2～圖6、圖8～圖11同。

與正常對照組相比,模型對照組倉鼠的腎周脂肪系數極顯著上升(P<0.01),表明高脂飲食易引起倉鼠腎周脂肪的積累;與模型對照組相比,匙羹藤酸劑量組倉鼠的腎周脂肪系數均極顯著下降(P<0.01),且匙羹藤酸低、中、高劑量組下降率分別為23.08%、23.08%和28.72%,說明匙羹藤酸可以抑制高脂膳食倉鼠體內脂肪的積累。

2.3 匙羹藤酸對倉鼠血清中血脂水平的影響

2.3.1 匙羹藤酸對倉鼠血清中TG水平的影響 由圖2可知,灌胃前,各組倉鼠之間的血清中的TG水平無顯著性差異(P>0.05),從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的TG水平極顯著上升(P<0.01),表明高脂飼料喂養能夠極顯著性提高倉鼠血清中TG的水平(P<0.01);與模型對照組相比,匙羹藤酸各劑量組倉鼠血清中的TG極顯著下降(P<0.01),下降率分別為39.67%、45.99%、53.15%,說明匙羹藤酸可以有效抑制高脂膳食倉鼠血清中TG水平升高。

圖2 匙羹藤酸對倉鼠血清中TG水平的影響Fig.2 Effects of gymnemic acid on the levels of TG in serum of hamster

2.3.2 匙羹藤酸對倉鼠血清中TC水平的影響 如圖3所示,灌胃前,各組倉鼠血清中TC水平無顯著性差異(P>0.05);從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的TC水平呈極顯著上升(P<0.01);與模型對照組相比,匙羹藤酸各劑量組倉鼠血清中的TC開始下降,下降程度不同,第4周下降率分別為11.28%、23.44%、30.27%,說明匙羹藤酸可以抑制高脂膳食倉鼠血清中TC的升高。

圖3 匙羹藤酸對倉鼠血清中TC水平的影響Fig.3 Effects of gymnemic acid on the levels of TC in serum of hamster

2.3.3 匙羹藤酸對倉鼠血清中HDL-C水平的影響 如圖4所示,灌胃前,各組倉鼠之間的血清中的HDL-C水平無顯著性差異(P>0.05),從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的HDL-C水平極顯著性提高(P<0.01),這可能是由于高血脂倉鼠體內血脂水平過高而引起自身體內出現了一定程度上的調節作用。與模型對照組相比,匙羹藤酸各劑量組倉鼠血清中的HDL-C均無顯著性差異(P>0.05),表明匙羹藤酸并不能提高倉鼠體內HDL-C水平。

圖4 匙羹藤酸對倉鼠血清中HDL-C水平的影響Fig.4 Effects of gymnemic acid on the levels of HDL-C in serum of hamster

2.3.4 匙羹藤酸對倉鼠血清中non-HDL-C水平的影響 由圖5可知,灌胃前,各組倉鼠之間的血清中的non-HDL-C水平無顯著性差異(P>0.05),從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的non-HDL-C水平極顯著性升高(P<0.01)。表明高脂飼料喂養能夠明顯提高倉鼠血清中non-HDL-C的水平;與模型對照組比,匙羹藤酸中、高劑量組倉鼠血清中的non-HDL-C水平極顯著性下降(P<0.01)。表明匙羹藤酸可以抑制non-HDL-C水平的升高,對高脂血癥有緩解作用。

圖5 匙羹藤酸對倉鼠血清中non-HDL-C Fig.5 Effects of gymnemic acid on the levels of non-HDL-C in serum of hamster

2.4 匙羹藤酸對倉鼠肝臟的保護作用

脂肪肝是最常見的肝功能異常的一種疾病,高血脂會導致肝脂肪性病變,檢測血清中ALT、AST的含量是檢驗肝損傷程度的一種常用方法,并且在反映其損傷程度時AST 最為敏感[27]。

2.4.1 匙羹藤酸對倉鼠血清中ALT、AST的影響 由圖6可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中ALT和AST活力均極顯著性升高(P<0.01),說明高脂飲食會導致倉鼠肝臟細胞損傷;與模型對照組相比,匙羹藤酸劑量組倉鼠血清中ALT、AST活力極顯著降低(P<0.01),說明匙羹藤酸可以減緩高脂膳食造成的倉鼠肝損傷。

圖6 匙羹藤酸對倉鼠血清中的ALT和 AST水平的影響Fig.6 Effect of gymnemic acid on serum ALT and AST levels in serum of hamster

2.4.2 肝組織形態學分析 如圖7所示,正常對照組倉鼠的肝小葉結構完整,肝竇清晰可見,細胞排列緊密,整齊有序,邊緣界限明顯,核仁明顯,細胞質均勻且豐富;模型對照組倉鼠肝細胞排列松散無序,細胞質中出現了大量的脂肪滴空泡,大小不一,將細胞核擠壓至細胞邊緣,肝細胞損傷嚴重,出現了嚴重的脂肪肝;與模型對照組相比,匙羹藤酸低、中、高劑量組的倉鼠肝臟中肝小葉結構相對完整,細胞排列相對緊密整齊,細胞質中的脂肪滴空泡明顯減少,細胞質相對豐富,倉鼠的脂肪肝變性程度有所緩解,并且呈劑量依賴關系。這一結果與肝臟的臟器指數和血清中的ALT、AST水平的結果一致,表明匙羹藤酸可以在一定程度上減緩肝臟細胞脂肪變性,具有預防脂肪肝形成作用。

圖7 匙羹藤酸對倉鼠肝臟組織切片的影響(100×)Fig.7 Effects of gymnemic acid on liver slices in hamsters(100×)

2.5 匙羹藤酸對倉鼠血清中膽固醇調控關鍵酶活的影響

肝臟是調節體內膽固醇代謝的重要器官。膽固醇在肝臟中的三條主要的代謝途徑為內源性膽固醇合成、膽固醇向膽汁酸的轉化以及LDL-R對LDL的接受途徑[28]。因此機體可以通過調節與膽固醇代謝相關酶3-羧基-3甲基-戊二酰CoA還原酶(HMGCR)、膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)、膽固醇酰基轉移酶(ACAT)等的水平來調節膽固醇在體內的代謝。

2.5.1 匙羹藤酸對倉鼠血清中HMGCR酶活的影響 HMGCR是機體中膽固醇合成的主要限速酶[27]。由圖8可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中HMGCR水平顯著升高(P<0.05),表明高脂飲食會促進機體內HMGCR活力的升高,促進膽固醇的合成。與模型對照組相比,中、高劑量組倉鼠血清中HMGCR水平極顯著下降(P<0.01),說明匙羹藤酸可以降低HMGCR水平,通過抑制HMGCR的合成來降低膽固醇的合成。

圖8 匙羹藤酸對倉鼠血清中的HMGCR活力的影響Fig.8 Effect of gymnemic acid on serum HMGCR activity on serum of hamster

2.5.2 匙羹藤酸對倉鼠血清中CYP7A1酶活的影響 膽固醇7-羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成代謝經典途徑中肝臟合成并促使膽固醇轉化成膽汁限速酶,是機體把膽固醇排除體外的重要途徑,對機體維持膽固醇代謝平衡起著重要的作用[27]。由圖9可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的CYP7A1水平極顯著下降(P<0.01),與模型對照組相比,中、高劑量組倉鼠血清中的CYP7A1水平極顯著升高(P<0.01)。說明匙羹藤酸可以提高倉鼠血清中CYP7A1水平,增加膽汁的合成,從而將膽固醇的排出體外,降低血液中膽固醇。

圖9 匙羹藤酸對倉鼠血清中的CYP7A1活力的影響Fig.9 Effect of gymnemic acid on serum CYP7A1 activity in serum of hamster

2.5.3 匙羹藤酸對倉鼠血清中ACAT酶活的影響 ACAT是細胞內唯一催化游離膽固醇和長鏈脂肪酸合成膽固醇酯的酶,抑制體內的ACAT活性可減少食物中的膽固醇及隨膽汁排泄的膽固醇在小腸的吸收,減少肝臟中膽固醇酯的生成及極低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein,VLDL)的分泌。由圖10可知,正常對照組、模型對照組及匙羹藤酸各劑量組的倉鼠血清中ACAT水平沒有顯著性差異(P>0.05)。因此匙羹藤酸和高脂膳食對ACAT的活力沒有影響。

圖10 匙羹藤酸對倉鼠血清中的ACAT活力的影響Fig.10 Effect of gymnemic acid on serum ACAT activity in serum of hamster

2.6 匙羹藤酸對倉鼠肝臟中HMGCR酶活的影響

HMGCR主要存在于肝臟中。由圖11可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中HMGCR水平極顯著升高(P<0.01),表明高脂飲食會促進肝臟內HMGCR活力的升高,促進膽固醇的合成。與模型對照組相比,匙羹藤酸中、高劑量組倉鼠血清中HMGCR水平極顯著下降(P<0.01),低劑量組HMGCR水平顯著下降(P<0.05),說明匙羹藤酸可以降低HMGCR水平,通過抑制HMGCR的合成來降低膽固醇的合成,這一結果與血清中的一致。

圖11 匙羹藤酸對倉鼠肝臟中的HMGCR活力的影響Fig.11 Effect of gymnemic acid on serum HMGCR activity in liver of hamster

3 結論

本實驗結果表明低、中、高劑量的匙羹藤酸均能不同程度地抑制高脂飲食倉鼠的血脂水平,減少腎周脂肪的積累,抑制肝臟發生脂肪性病變。匙羹藤酸可以抑制HMGCR、提高CYP7A1的水平,對ACAT沒有影響,表明匙羹藤酸可以通過抑制HMGCR的水平來抑制體內膽固醇的合成,通過提高CYP7A1的水平來促進膽固醇向膽汁酸的轉化,從而促進膽固醇的排泄,來控制機體內血脂水平的升高。本文研究結果為匙羹藤酸降血脂提供了科學依據,將來可以通過Western Blot和qPCR的方法對膽固醇調節相關酶的基因和蛋白表達水平進行研究。