高脂飲食對不同性別小鼠腸道菌群的影響

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(1.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006;2.廣東工業大學生物醫藥學院,廣東廣州 510006)

腸道微生物作為“人類第二基因組”[1],數量龐大、種類繁多,且不同種類的腸道微生物相互作用,可共同調控宿主的免疫功能,維持宿主腸道內環境的穩定[2]。人類和小鼠腸道微生物組成相似,主要分為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門及變形菌門等[3]。正常情況下,腸道微生物與宿主及外部環境處于平衡狀態,并在能量調節、營養吸收和免疫調節等方面發揮著重要的作用[4],一旦平衡遭到破壞,引起腸道菌群失調,將導致宿主代謝紊亂,對宿主健康造成威脅。因此,了解腸道微生物的組成結構及其變化,對于維護宿主健康及疾病預防至關重要。

眾所周知,膳食結構[5]、遺傳因素[6]、分娩方式[7]、哺乳方式[8-9]、抗生素和藥物的使用[10-11]等都會影響腸道微生物的組成,其中膳食結構發生改變的24 h內,腸道微生物的組成就會發生明顯變化[12]。研究人員對89種近交系小鼠的腸道微生物進行了獨立分析,發現各品系小鼠的腸道微生物組成和多樣性均有明顯的差異,雖然性別對腸道微生物的影響不及宿主基因型[13],但提供了性別影響腸道微生物組成差異的指示性證據。另外,一項對75名男性和絕經后女性的腸道菌群的研究表明,在不考慮身體質量指數的情況下,微生物群落多樣性和總體組成沒有顯著性差異[14]。然而另一項對1135名男性和女性的研究中,不同性別人群腸道微生物的組成有顯著差異[15]。總之,對動物和人類的研究均表明,性別也是影響腸道微生物的重要因素[13,16]。

近年來,隨著生活水平的不斷提高,人類的飲食習慣越來越趨向于“西方化”的高脂、高糖膳食。據文獻報道,飲食結構與宿主性別共同作用,影響腸道微生物的組成[17]。而高脂飲食誘導雌性和雄性宿主腸道微生物的變化情況或趨勢是否一致尚不明確[18]。因此,為了研究高脂飲食對雌性和雄性小鼠腸道微生物組成結構的影響,以不同性別的C57BL/6J小鼠為研究對象,分別用基礎飼料和高脂飼料飼喂,飲食干預6周后收集小鼠的新鮮糞便,對小鼠糞便細菌16S-rDNA的V3+V4區域進行測序,分析比較雌性和雄性小鼠腸道微生物菌群的組成結構,探討高脂飲食對不同性別小鼠腸道微生物的影響,為深入研究飲食及性別因素對腸道微生物的影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物 16只6周齡SPF級C57BL/6J小鼠(動物生產許可證號:SCXK(蘇)2018-0008),雌雄各半,體重15～18 g,購自南京大學動物模式研究所;基礎飼料(舒克貝塔1010013) 江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司;45%高脂飼料(Research Diets,D12451) 北京凱國科技有限公司;飼料主要物質供能比見表1;E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司;瓊脂糖粉末 北京沃比森科技公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen Biosciences公司;引物341F/806R 生工生物公司合成;KOD Buffer/dNTPs/KOD聚合酶 寶日醫生物技術(北京)有限公司。

表1 飼料主要物質供能表Table 1 Energy supplyTable of main materials of feed

微量移液器 德國Eppendorf公司;普通PCR儀 美國Bio-rad公司;電泳儀 美國Bio-rad公司;液氮罐 美國Thermo公司;凝膠成像儀 美國Bio-rad公司;QuantiFluor-ST熒光計 美國Promega公司;低溫臺式高性能離心機 美國Thermo公司;Milli-Q純水儀 美國Millipore公司;超低溫冰箱 長虹美菱股份有限公司;全自動雪花制冰機 南京先歐科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 C57BL/6J小鼠按雌雄各隨機分為對照組(F-CON&M-CON)和高脂組(F-HF&M-HF),每組4只小鼠,基礎飼料適應性喂養14 d后,分別飼喂基礎飼料(CON)和45%高脂飼料(HF),飼養環境為晝夜12 h交替,控制室內溫度在22～25 ℃,濕度在55%～65%,食物和水自由攝取。

1.2.2 樣本采集 飲食干預六周后,收集每組小鼠新鮮清潔無污染的糞便樣本,迅速置于液氮中,并于-80 ℃保存備用。

1.2.3 腸道微生物DNA提取及PCR擴增 按照E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒(Omega Biotek,Norcross,GA,U.S.)提取糞便DNA樣品,對提取后的DNA產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。然后用帶有barcode的特異引物擴增16S-rDNA的V3+V4區域。引物序列為341F:CCTACGGGNGGCWGCAG;806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT。擴增體系為:5 μL的10×KOD Buffer,5 μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL的KOD聚合酶和100 ng模板DNA,最終體積為50 μL。擴增條件如下:95 ℃預變性2 min,隨后 98 ℃ 變性10 s,62 ℃ 退火30 s,68 ℃延伸30 s,共27個循環,最后68 ℃延伸10 min。

1.2.4 建庫和測序 從2%瓊脂糖凝膠中回收擴增產物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,GA,U.S.)純化擴增產物,再經QuantiFluor-ST(Promega,U.S.)熒光計進行定量。將純化的擴增產物等量混合,連接測序接頭,根據Illumina說明構建測序文庫,以Hiseq2500的PE250模式上機測序,將得到的原始Reads存儲到NCBI序列讀存檔(SRA,Sequence Read Archive)數據庫中用于后續分析[19]。

1.2.5 數據處理 利用Mothur(v1.39.1)軟件對tag序列進行去冗余處理[20],從中挑選出 unique tag 序列,然后用 Uparse(v9.2.64_i86linux32)軟件對所有樣品的全部 Effective Tags 序列按97%的相似性聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),再與RDP(Ribosomal Database Project)數據庫進行比對,對OTUs進行物種注釋[21]。基于OTU的豐度結果,利用R語言中的GUniFrac(v1.0)計算兩兩樣本間的Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離[22],然后進行多元統計的主坐標分析(PCoA,Principal coordinates analysis)和非加權組平均聚類分析(UPGMA,Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)。

1.3 統計學分析

利用GraphPad Prism 7.0統計學軟件對圖像分析的數據進行統計學分析,所有數據的分析結果均以平均數±標準誤差(Mean±SED)表示,兩組間的比較采用t檢驗(t-test),P<0.05為差異顯著,有統計學意義。

圖1 不同飲食組小鼠體重和腸道微生物主坐標分析Fig.1 The principal coordinates analysis (PCoA)of weight and gut microbiota of different diet groups of mice注:F-CON代表雌性基礎飼料組,F-HF代表雌性高脂組;M-CON代表雄性基礎飼料組,M-HF代表雄性高脂組;不同形狀表示不同的飲食組;n=4,與對照組相比,* P<0.05,** P<0.01。

2 結果與分析

2.1 高脂飲食對小鼠腸道微生物組成的影響

由圖1A可知,飲食干預6周后,小鼠體重已有明顯差異,同一性別小鼠,高脂飲食組體重顯著高于基礎飲食組體重(P<0.05)。OTUs主坐標分析結果表明,基礎飲食小鼠和高脂飲食小鼠腸道微生物的數據點表現出各自聚集分布的情況,并且膳食因素對腸道微生物差異的貢獻值達52.46%(圖1B)。說明飲食干預影響了小鼠腸道微生物組成,這可能與營養物質的吸收以及能量代謝水平差異有關。

2.2 高脂飲食對小鼠腸道微生物多樣性的影響

由圖2可知,對照組小鼠和高脂組小鼠腸道微生物以組為單位聚集在同一簇;在對照組中,雌性小鼠和雄性小鼠腸道微生物各自成簇,高脂組小鼠腸道微生物也基于性別各自成簇,表明性別也是影響腸道微生物多樣性的因素。相同飲食的小鼠之間的共同分支距離更短且空間距離更近,意味著腸道微生物更相似,說明高脂飲食改變了雌性和雄性小鼠腸道微生物多樣性,同時也進一步證實了飲食結構和性別是影響腸道微生物多樣性的重要因素。

圖2 不同飲食組小鼠的腸道微生物UPGMA分類樹Fig.2 The UPGMA cluster dendrogram of gut microbiota of different diet groups of mice注:每個分支對應一個樣本,分支距離代表 相似性,距離越短,樣品越相似。

2.3 高脂飲食對雌性和雄性小鼠腸道微生物菌門組成的影響

在門分類水平上,對小鼠腸道微生物組成的分析發現,各組小鼠優勢菌均由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門組成。如表2所示,高脂飲食條件下,雌性小鼠變形菌門相對豐富度為(5.46%±0.55%),顯著低于對照組(P<0.05);而雄性小鼠變形菌門的相對豐富度為(7.86%±0.68%),相比于對照組(3.01%±0.31%)極顯著升高(P<0.01)。另外,高脂飲食條件下,雌性小鼠放線菌門的相對豐富度(8.57%±1.15%)與對照組(0.78%±0.07%)相比極顯著升高(P<0.01),而雄性小鼠放線菌門相對豐富度(2.92%±0.66%)與對照組(3.99%±2.30%)相比無顯著下降(P>0.05)。以上數據表明高脂飲食對不同性別小鼠腸道菌群產生不同的影響,推斷不同菌門在宿主體內可能有不同的代謝偏好,并且變形菌門對飲食干預的反映較為顯著,這也許是由于菌群與性激素水平之間的相互作用,繼而調節腸道微生態,但具體機制還需進一步研究。

2.4 高脂飲食對雌性和雄性小鼠腸道微生物菌種組成的影響

由圖3A可知,在種分類水平上各組小鼠腸道微生物都能夠注釋到的物種,主要包括Lactobacillusmurinus、Lachnospiraceaebacterium615、Blautiacoccoides、Leptum、Bacteroidesacidifaciens等菌種。如圖3B所示,高脂飲食干預下,厚壁菌門分類下的L.murinus菌種在雌性小鼠的相對豐富度為(3.13%±0.28%),與對照組(1.55%±0.23%)相比極顯著上升(P<0.01),但該菌種在雄性小鼠中呈相反趨勢,高脂飲食下其相對豐富度為(1.27%±0.22%),與對照組(3.88%±1.44%)相比雖無顯著性差異,但呈下降趨勢,進一步證實高脂飲食干預下,腸道微生物因宿主性別不同而發生不同的變化。

表2 門分類水平優勢菌門的相對豐富度(%)Table 2 The relative abundance of predominate gut microbiota at phylum level(%)

注:與相同性別對照組相比,*P<0.05;**P<0.01。

圖3 小鼠腸道微生物種水平組成及相對豐富度Fig.3 The composition and relative abundance of gut microbiota at species level of mice注:與對照組相比,** P<0.01。

3 討論

本研究使用45% 高脂飼料飼喂8周齡雌性和雄性小鼠,模擬當前人類“西方化”的高脂飲食習慣。據文獻報道,成人體內重要的腸道微生物包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門等[3],本研究結果顯示,在門分類水平上,所有小鼠的優勢菌門也是由這4大類組成。目前關于性別對腸道菌群組成的影響的報道,結果不一致[13,17,23-24],考慮是由于飲食、宿主遺傳背景和年齡等因素在一定程度上的影響所致。本研究旨在探討高脂飲食與性別對腸道微生物的不同影響。顯然,在遺傳背景和年齡相同的情況下,飲食和性別是影響腸道微生物組成的重要因素。Carmody R等[25]對五種近交系小鼠的研究發現:小鼠的腸道微生物因飲食波動呈線性劑量關系,表明飲食在宿主腸道微生物差異中起到了主導作用,本研究也充分表明了高脂飲食對腸道微生物菌群的影響顯著(貢獻值達52.46%)。此外,在高脂飲食條件下,雄性小鼠和雄性小鼠變形菌門出現相反的變化,此種差異可能是由于宿主體內激素水平差異引起菌門代謝偏好所致[26]。另有研究表明,肥胖女性體內的放線菌門豐富度升高[27],本研究也發現:在高脂飲食條件下,雌性小鼠放線菌門的豐富度顯著升高(P<0.05),但雄性小鼠卻無顯著變化(P>0.05),這可能與宿主能量吸收及代謝水平有關[28]。進一步分析種分類水平上的菌種差異,發現在高脂飲食條件下,厚壁菌門下的Lactobacillusmurinus菌種在雌性小鼠中顯著上升(P<0.05),但在雄性小鼠中無顯著變化(P>0.05),Pan等[29]發現L.murinus菌種能夠降低無菌小鼠的腸道通透性和血清內毒素水平,從而減輕衰老菌群引起的炎癥反應,說明該菌種具有一定的抗炎作用;另有研究表明L.murinus菌種并不會誘導C57BL/6小鼠肥胖[30],因此該類菌種與肥胖產生的聯系需要進一步驗證。

4 結論

本研究證實了高脂飲食可以改變雌性和雄性小鼠腸道微生態的結構,但對雌性和雄性小鼠腸道微生物組成及變化的影響并不完全相同,為深入研究飲食及性別因素對腸道微生物的影響提供依據。然而,研究結果并不能解釋這種差異是否與激素水平、能量代謝等因素相關,因此還有待進一步研究。