市售草莓腐敗菌的分離鑒定及拮抗酵母的篩選

朱寒冰,明瑞虎,張 媛,郭嘉鵬,李 洋,周幗萍

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023)

草莓(Fragariaananassa)[1]是一種廣泛種植的草莓屬雜交品種,以其特有的香氣、鮮紅的顏色、多汁的質地和甜度而受到廣泛的贊賞。草莓在生長和貯藏過程中極易受到微生物侵染而腐爛變質,從而造成巨大的經濟損失。目前,田間病害防控及采后果實貯藏保鮮主要依靠化學制劑。化學制劑因其高效性及便利性在農業領域備受歡迎,但化學制劑的廣泛使用對人體和環境都造成了巨大危害。水果防腐需要尋求更安全、環保并高效的方法,其中生物防治是替代化學防治的有效措施之一[2]。生物防治和化學防治相比具有經濟、有效、安全、污染小和產生抗藥性慢等優點[3]。酵母菌因具有拮抗效果好、繁殖速度快、抗逆能力強、安全性高、遺傳穩定、抑菌譜較廣以及可以和化學殺菌劑共同使用等優點而成為水果采后生物防治研究的熱點[4]。利用酵母菌進行水果采后病害生物防治,其拮抗機理主要表現為營養或空間競爭、對病原菌的寄生、抗生作用及誘導抗性等。

Wilson等[5]在20世紀90年代就開始研究水果采后病害,并致力于生物防治的研究,在生防酵母方面取得了不錯的成果。隨著對生防酵母的深入研究,世界各國的科研工作者在拮抗酵母生物防治研究方面取得了顯著性的成果,研究發現膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)可以有效控制梨上的灰霉病[6];卡利比克畢赤酵母(Pichiacaribbica)可以有效控制桃子的根霉腐爛[7];海洋紅酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)可以有效控制柑橘的綠霉病和青霉病[8];異常畢赤酵母(Pichiaanomala)SRF可以控制蘋果的青霉病[9];釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可以有效控制葡萄的黑曲霉病[10]。但因為研究酵母的深度尚淺,加上其不易長期儲存和不穩定的性質使酵母制劑商業化變得艱難。在已經實現商業化的生防制劑中,酵母生防制劑仍占了很大的比例,并且對病害的控制效果十分顯著。不過酵母生防制劑的商業化應用均在國外,國內尚未有成功案例,并且關于酵母生防制劑的相關研究報道較少,這說明在我國酵母制劑有著非常大的研究空間和應用前景[2]。

本文主要從市售草莓中分離腐敗污染菌,并通過體內和體外實驗分析酵母菌株對腐敗菌的相對抑制程度,并篩選出拮抗作用良好并具有較大生防潛能的酵母,為草莓保鮮提供一些重要依據,期望能為我國酵母生防制劑的選擇與應用發展提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售新鮮草莓 分別采樣于:武漢光谷水果攤(2018.01.12)、黃石市水果超市(2018.03.04)、天門市漁薪鎮水果店(2018.03.05)、武漢東西湖常青公寓水果超市(2018.03.09)、武漢苗栗路水果市場(2018.08.17)；新鮮冬棗 武漢東西湖坤利生活超市(2018.08.11)(2018.09.02)、武漢常青花園武商量販(2018.08.15);用于篩選的酵母菌株 分離純化自草莓、芒果、蘋果、橙子和葡萄等多種水果表面附生酵母和部分本實驗室保存株;平板計數瓊脂(plate count agar,PCA)、孟加拉紅培養基(Rose Bengal Medium,RBM) 北京陸橋公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA) 英國OXOID公司;察氏培養基 自制;Premix Taq、DL2000 DNA Marker、Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)、核酸染料Goldview 日本TaKaRa公司;瓊脂糖 西班牙Biowest公司;聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)引物合成 蘇州金唯智科技有限公司。

普通光學顯微鏡 日本Nikon公司;DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈安泰公司;數顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器有限公司;BIO-RAD T100 PCR儀器 聯想生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣及統計 收集市售草莓,盡快送回實驗室冷藏,于24 h內分析好果和壞果的比例,并根據病斑顏色和氣味等進行分類統計。

1.2.2 污染菌的分離及反接驗證其感染能力 分離:將感染變質的草莓樣品分為兩組,一組將10 g發病組織碎片浸泡于90 mL無菌水中,靜置10 min左右,稀釋至10-2和10-3涂布于PDA或RBM上;另一組取病斑邊緣的組織酒精消毒外表面后直接貼片于PDA或RBM培養基上。28 ℃培養3～5 d,挑取長好的邊緣菌絲劃線培養純化。反接:取健康的草莓,75%酒精浸泡1 min消毒,并用無菌水洗滌。分別用有傷和無傷兩種方式反接,有傷用無菌刀刮取并稱量純化后約10 mg菌絲并用無菌接種針挑取接至傷口處,無傷直接挑取等量純化后菌絲接種于草莓表面,室溫下培養3 d,觀察接種處的病癥,判斷是否與自發病腐爛狀況相符。

1.2.3 致腐污染菌的鏡檢及28S rDNA序列分析 致腐污染菌的霉菌根據菌落特征和普通光學顯微鏡物鏡鏡檢情況進行初步分類。霉菌采用液氮研磨法及試劑盒抽提DNA,引物為真菌通用引物NL-1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和NL-4(5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′),按照相應體系進行PCR過程[11],產物送蘇州金唯智公司或武漢金開瑞公司測序,在Genbank用BlastN進行比對,將腐敗菌鑒定到屬。

1.2.4 針對腐敗菌拮抗酵母的初步篩選 分別用直徑為5 mm的打孔器取培養3～5 d的污染菌邊緣菌塊,接種于PDA培養基中心,距離中心部分1.5 cm處等距以同樣形狀及直徑接種待篩選的酵母,28 ℃培養7 d,測量并計算由不同酵母接種在周圍時每種霉菌延該酵母方向的平均生長半徑r與空白組霉菌的平均生長半徑R的差作為酵母菌株對霉菌的相對抑制長度,計算該長度所占R的百分比用來表示菌株對霉菌生長相對抑制程度,將相對抑制程度按照20%、40%、60%為界劃分為四個級別,完成抗菌譜。選出對至少三種腐敗菌的相對抑制程度均超過20%的拮抗酵母進行進一步鑒定。

1.2.5 拮抗酵母的26S rDNA序列分析 用反復凍融法或者試劑盒抽提酵母DNA,引物為真菌通用引物NL-1和NL-4,參照文獻進行PCR過程[11],產物送蘇州金唯智公司或武漢金開瑞公司測序,在Genbank用BlastN進行比對,將拮抗酵母鑒定到屬和種。

圖1 草莓污染菌的形態統計結果Fig.1 Morphological statistics of strawberry rot-causing organisms

1.2.6 反接水果驗證拮抗作用 最初采用草莓做反接驗證,草莓質地較軟,表面常沾染大量土壤微生物,不容易表面消毒,且正常新鮮草莓常溫保存3～5 d就出軟化水,接種的霉菌一般需要3～5 d才能看到生長,所以不宜進行拮抗實驗的反接驗證。后改用冬棗做為反接驗證材料,但冬棗皮質較厚,無傷情況下接種效果不佳,實驗全部做有傷處理。采集市售冬棗,75%酒精浸泡消毒1 min后,無菌水洗滌,5 mm直徑打孔器對果實進行有傷處理后分為四組進行不同接種。實驗組:傷口處加入30 μL濃度約為108CFU/mL的酵母懸浮液,1 h后,接入15 μL濃度約為5×104CFU/mL霉菌孢子懸浮液。酵母對照組:傷口處加入30 μL濃度約為108CFU/mL的酵母懸浮液,1 h后,接入15 μL無菌水。霉菌對照組:傷口處加入30 μL無菌水,1 h后,接入15 μL濃度約為5×104CFU/mL霉菌孢子懸浮液。空白對照組:傷口處加入30 μL無菌水,1 h后,再接入15 μL無菌水。果實晾干后用保鮮膜封口以保持濕度(95%左右)28 ℃貯藏,分別于第4和第6 d測量各果實傷口處病斑直徑,觀察傷口狀況。每組2個重復。

1.3 數據處理

對致腐菌和拮抗酵母進行序列分析:利用Seqman軟件對相應序列進行處理與拼接,并在Genbank用BlastN進行比對。

2 實驗結果

2.1 草莓采樣情況

根據隨機采樣4批次草莓果實腐爛情況確認好果和壞果的比例,并分析病斑情況,了解市售草莓產生病斑在顏色、形態、氣味上的主要類型及比例,詳細信息見表1。

表1 草莓采樣情況統計(%)Table 1 Purchase statistics of strawberry(%)

肉眼觀察到大部分腐爛草莓病斑處有一定的絲狀或絨狀菌絲生長,初步判斷草莓的污染菌以霉菌為主。

2.2 污染菌的反接與鏡檢

將分離出的草莓污染菌分別以有傷和無傷的方式反接至健康草莓上,將其確定為草莓腐敗污染菌。對根據病斑特征初步分類的草莓污染菌(G-2、B3-7、S-4、I-6、C-3)進行拍照,并鏡檢觀察。根據草莓腐敗情況、污染菌菌落的形態及顯微形態可將分離出的草莓污染菌的種屬初步確定下來,主要有5種不同的典型霉菌,見圖1。

表2 分離菌的28S rDNA序列分析Table 2 Sequence analysis of 28S rDNA

G-2在受污染草莓和反接草莓上表現為白色粉狀,菌絲不明顯,可使草莓快速軟爛,鏡檢觀察到細小成鏈的節孢子;C-3菌落與G-2相似較為平整,但表現為綠色,鏡檢可觀察到菌絲頂端的分生孢子;B3-7表現為灰色絨狀菌絲厚密,在草莓表面擴散速度更快,培養后期顏色變深,鏡檢可見褐色棒狀成鏈孢子,孢子有磚裝分隔;S-4菌絲為長絲狀,較稀疏,可以快速侵蝕整顆草莓,鏡檢觀察到菌絲頂端膨大的孢子囊;I-6在草莓和察氏培養基上的菌絲均為灰白色,可以使草莓軟爛出水,鏡檢可見卵狀成簇的分生孢子。

一般來說有傷接種的果實腐敗程度更高,而B3-7無傷接種至草莓上反倒污染更嚴重,分析可能因為草莓的大小、含水量不同,對霉菌生長和觀察比較可能有一定的影響;根據反接在草莓上的B3-7菌株長勢可知該菌菌絲厚密,更傾向于在果實表面迅速擴散,沒有深入內部使果肉軟爛,有傷處空間小,氧氣濃度低,生長可能減緩。有傷無傷培養時間一致,而有傷處理時霉菌接種在傷口內到長出表面還需要一定時間。

2.3 污染菌28S rDNA序列分析結果

根據測序結果進行比對,鑒定污染霉菌主要為以下5種菌:鏈格孢屬(Alternaria)、毛霉屬(Mucor)、枝孢屬(Cladosporium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。

其中白地霉在胡蘿卜和黃瓜上的擴展速度和范圍均較小、危害較輕,而在番茄、桃、荔枝、龍眼、葡萄等果實上擴展速度較快,危害重[12],在受污染草莓上表現為白色粉狀且菌絲不明顯,可使草莓快速軟爛。Skavia[13]和Moline[14]認為,成熟或過熟的水果蔬菜最容易受到白地霉的感染。鏈格孢菌是一種死體營養型植物病原真菌,多生于植物的枯死部分和衰弱瀕死的組織,或腐生于多種有機物質上或土壤中[15]。鏈格孢菌可引起多種植物特別是農作物病害,能夠引起包括小麥、馬鈴薯、玉米、煙草、番茄、蘋果、梨等幾十種農作物的真菌性病害,現在看來它同樣在草莓上廣泛寄生并引起病害,寄生部位主要在表皮[16-17]。灰葡萄孢菌可侵染200多種植物的多個部位引起灰霉病[18]。毛霉和枝孢屬(CladosporiumLink)真菌分布廣泛較為常見。一些枝孢屬真菌是植物的重要病原物,主要侵染葉片,也可以侵染植物枝條和果實,比如說草莓果實,使其表皮生長了綠色菌絲,造成植物產量降低,品質變劣,帶來嚴重的經濟損失[19]。此外,還有一些枝孢屬真菌可以侵染動物甚至人類,引起疾病[20-22]。毛霉寄生在草莓上時菌絲為長毛狀,較稀疏,但侵蝕速度很快。

2.4 拮抗酵母鑒定及其抗菌譜

通過平板對峙實驗,可以直觀看出各酵母菌株對枝孢霉C-3的抑制效果,如圖2。通過從191株酵母樣本中篩選出對腐敗菌有一定拮抗作用的菌株23株,經過鑒定歸屬于17種酵母,見表3。在這17種酵母中每種各挑出拮抗效果最好的1株作為代表,統計這17株酵母對各腐敗菌的抑制程度,見表4。

圖2 部分酵母對枝孢霉C-3的平板抑制效果Fig.2 Inhibition effect of some yeasts against Cladosporium tenuissimum C-3

表3 酵母的26S rDNA序列分析Table 3 Sequence analysis of 26S rDNA

表4 拮抗酵母分離源及抗菌譜Table 4 Source separation and antifungal spectrum of Antagonistic yeast

注:-無明顯抑制作用:相對抑制程度<20%;+有抑制作用:20%≤相對抑制程度<40%;++抑制作用強:40%≤相對抑制程度<60%;+++抑制作用很強:抑制程度≥60%。

通過1.2.4計算每種霉菌的相對生長抑制百分比，并劃分級別來確定17種酵母對五種草莓腐敗污染菌的拮抗活性,結果如表4所示。對白地霉G-2,17種酵母的相對抑制程度均大于或等于60%,抑制效果最好的是Y2和F-1,抑制程度均為87.1%;對枝孢霉C-3,R4-4和Y2兩種酵母抑制程度分別為70.3%和64.9%;13種引起40%～60%的抑制,其余2種引起的抑制程度在區間20%～40%;對鏈格孢菌B3-7,R4-4和R5-5引起的抑制程度均為60.7%,5-2引起42.9%的抑制,4種酵母引起的抑制程度在區間20%～40%,其余十種無明顯抑制作用;對灰葡萄孢菌I-6,S4-1引起抑制程度為76.7%,10種酵母引起40%～60%的抑制,其余6株引起的抑制程度在區間20%～40%;對毛霉S-4,Y1,Y2,Y3引起抑制程度大于60%,S4-1引起44.2%的抑制,另外9種酵母引起的抑制程度在區間20%～40%,其余4種無明顯抑制作用。

以上對峙實驗中,5-2,3-38,3-41,R5-5,R4-4,Q6-3,S4-1這七種酵母對五種草莓腐敗污染菌均有良好的抑制作用,其中R4-4,R5-5,S4-1尤為突出,它們的鑒定結果為:黏紅酵母,淺黃隱球酵母及美極梅奇酵母。其中R4-4對白地霉和枝孢霉及鏈格孢菌的抑制程度分別為83.9%、70.3%和60.7%,對灰葡萄孢菌和毛霉的抑制率也都高于37%。

2.5 反接于果實上拮抗效果

五種污染菌單獨接種在冬棗上均能產生肉眼可見的腐敗情況和病斑,其中接種白地霉,鏈格孢霉和灰葡萄孢菌后均能肉眼可見從有傷部位蔓延長出的白色菌絲,而毛霉和枝孢霉則可在冬棗內部生長,使果實內部腐爛,發生皺縮。

將初篩的17株酵母全部進行了反接實驗,表5中列出部分抑菌效果顯著且安全性高的9株酵母的反接情況。大部分酵母反接在果實冬棗上對白地霉有很好的拮抗作用,對毛霉的抑制作用不佳。

表5 酵母在果實上的拮抗效果Table 5 Antagonistic effect of yeast on jujube fruit

根據僅反接酵母的冬棗是否發生腐敗判斷該酵母是否適合作為生防酵母;根據同時接種霉菌和酵母的冬棗的平均病斑直徑與僅接種霉菌的病斑直徑進行比較,判斷酵母是否擁有在果實上抑制腐敗污染菌的能力。體內實驗的篩選結果表明:S4-1,3-41,Y2,Y3,R5-5,Q6-3六株酵母在冬棗上對五種腐敗污染菌均有一定程度的抑制作用,其中S4-1和Y2的抑制作用最為明顯,它們分別屬于美極梅奇酵母和奧默柯達菌。霉菌對照組:在接種除枝孢霉以外的其他四種致腐污染菌的冬棗上,病斑平均直徑均在2.6 cm以上,接種枝孢霉平均病斑直徑1.30 cm;實驗組:接種S4-1拮抗酵母后再分別接種五種致腐菌,結果平均病斑直徑均控制在1.2 cm以下,且完全抑制葡萄孢菌的生長;接種Y2 后再分別接種五種致腐菌,結果平均病斑直徑控制在0.95 cm以下,且完全抑制白地霉G-2和鏈格孢菌B3-7的生長。

3 結論與討論

草莓不易保存,壞果率較高。污染菌主要是霉菌,細菌和酵母類的污染罕見。經鑒定污染霉菌是空氣和環境中常見霉菌如毛霉、鏈格孢菌、白地霉,枝孢霉屬和灰葡萄孢菌。因為草莓采后保質期很短,而霉菌生長較慢,可推測這些霉菌大部分應該是在草莓生長期污染,所以田間防治比采后管理更為重要。經過在平板上初步篩選與在果實上的二次驗證后,得到的17種酵母對五種腐敗菌有不同程度的抑制作用,但拮抗酵母應用在果實上的抑制效果與在平板對峙時有所區別,部分菌株沒有反應出很好的拮抗能力,分析原因可能與接種酵母懸液和霉菌孢子懸液的濃度有關,不同酵母若作為生防制劑應用時的最佳抑菌濃度應有一定區別,反接實驗時用同一種濃度的酵母懸液無法讓所有酵母菌都表現出最佳拮抗效果。每種酵母作為生防制劑的最佳使用濃度和溫度等條件還有待更深入的探究,將生防酵母制劑應用并產業化還有一定的困難。

其中在體內體外實驗中均表現出良好拮抗效果的酵母有美極梅奇酵母S4-1、淺黃隱球酵母R5-5、近玫色鎖擲孢酵母Q6-3及季也蒙畢赤酵母3-41等。此外黏紅酵母R4-4在體外實驗平板對峙中顯示拮抗作用最突出,體內實驗中反接于冬棗后得到拮抗能力最好的菌株有奧默柯達菌Y2。其他安全性較高且對腐敗菌抑制效果良好的菌株還有:海洋嗜殺酵母3-38、南極莫氏黑粉酵母5-2和粘質紅酵母Y3。

淺黃隱球酵母R5-5在本研究中顯示對白地霉G-2和鏈格孢菌B3-7有良好的抑制能力,有其他報道該種酵母可用于赤霉病生物防治,并且在野生山楂蘋果生防菌的篩選中有篩選出。美極梅奇酵母S4-1,南極莫氏黑粉酵母5-2與季也蒙畢赤酵母3-41[23]都可以很好地抑制灰葡萄孢菌I-6的生長。美極梅奇酵母和粘質紅酵母[24]抑制毛霉S-4的能力非常好。而海洋嗜殺酵母3-38在平板對峙實驗中對五種草莓污染菌都有很好地拮抗效果,反接后顯示出拮抗效果隨差強人意,可能與該酵母在不同水果表面的定殖能力有關。近年來,嗜殺酵母作為工業生產菌株而被廣泛使用,已應用于發酵、食品、農業、養殖、醫藥等領域[25]。在其他研究中嗜殺酵母在發酵生產中可以凈化發酵體系和環境;在食品工業中,可抑制野生酵母的污染[26]具有廣泛的抗真菌和酵母菌的作用,可用于蔬菜水果及飼料的防腐。