RPA等溫擴增技術檢測副溶血性弧菌

劉小青,嚴瓊英,陳國培,王遠洋,肖承榮,張永鑫,陳 晶

(深圳市計量質量檢測研究院,廣東深圳 518131)

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)是革蘭氏陰性細菌,具有嗜鹽性,可以從多種海產品中分離檢出[1]。副溶血性弧菌是一種常見的食源性致病菌,當食品中副溶血性弧菌達到106CFU/mL時即能引起食物中毒,其潛伏期為2～26 h[2],食用被副溶血性弧菌污染的食物后會引起以腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發熱等為主要癥狀的急性腸胃炎[3]。副溶血性弧菌的發病呈世界性分布,食源性疾病監測網的數據顯示,我國食源性疾病中副溶血性弧菌占比較高[4],每年約發生食源性副溶血性弧菌病495.1萬人次,由副溶血性弧菌導致急性胃腸炎的比例遠高于發達國家[5]。

目前,食品中副溶血性弧菌的檢測方法主要有傳統的生化培養鑒定法、免疫學法、質譜分析法以及分子生物學法等。傳統的生化培養法檢測周期長,操作復雜、繁瑣,一般需5～7 d才能報告陽性結果[6];免疫學方法因抗原位點易受環境因素的影響而發生變異,容易出現漏檢[7];質譜分析法雖然操作簡單、快速、高通量,但在上機之前需要純化獲得單菌落且儀器設備昂貴;分子生物學方法基于核酸檢測,經過幾十年的發展已日趨成熟,廣泛應用于食源性致病菌的檢測,具有靈敏度高、檢測周期短等優點。重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),作為分子生物學的一個分支,可在37～42 ℃恒溫下進行核酸快速擴增,水浴箱或恒溫設備即可滿足要求,在20 min內獲得檢測結果,是目前最具應用前景的方法之一。RPA技術在國外已應用于結核分支桿菌、埃博拉病毒、惡性瘧原蟲、黃熱病毒、轉基因食品等的檢測[8],在食源性致病菌的應用檢測中,國內未見將RPA技術應用于副溶血性弧菌檢測的報道。

表1 實驗所用標準菌株Table 1 Standard strains used in the experiment

檢測副溶血性弧菌的常用靶基因耐熱溶血素基因tdH,不耐熱溶血素基因tl,轉錄調控基因toxR、pR72H等均被報道會帶來假陽性和假陰性,irgB為鐵調節毒力監管蛋白基因,是新發現的副溶血性弧菌的種特異性基因[9],本文擬以irgB(鐵調節毒力監管蛋白基因)為靶基因,建立副溶血性弧菌的RPA-exo熒光探針快速檢測方法,以期縮短副溶血性弧菌的檢測時間,為檢測副溶血性弧菌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用標準菌株 見表1,樣品分離菌種為本實驗室日常檢測中從食品分離獲得;其他菌株 由中國疾病預防控制中心及深圳市疾病預防控制中心惠贈,見表2;營養肉湯、3%氯化鈉堿性蛋白胨水(3% APW)、弧菌顯色培養基 北京路橋技術股份有限公司;生化鑒定試劑條及Vitek MS相關試劑耗材 法國生物梅里埃公司;TwistAmpTMexo RPA試劑盒 英國TwistDx Inc公司;細菌DNA提取試劑盒(Version 3.0)、Premix Ex Taq酶 寶生物工程(大連)有限公司;引物、探針、irgB質粒 由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;實驗所用檢測樣品 從深圳龍華新區菜市場購買10份水產品,包括5份生魚(草魚2份、鯰魚2份、太陽魚1份),5份貝類樣品(生蠔3份、扇貝2份)。

Fresco 21冷凍離心機 美國Thermofisher公司;ND-1000紫外分光光度計 美國NanoDrop公司;PL2002電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;GENIUS 3漩渦振蕩器 德國IKA公司;干浴器 美國labnet;T16等溫擴增儀 英國TwistDX;Vitek 2 compact,Vitek MS 法國生物梅里埃公司。

表2 實驗室分離及惠贈菌株Table 2 Strains isolated from the laboratory and the beneficial strains

1.2 實驗方法

1.2.1 引物探針設計 從NCBI上下載包括ATCC 17802在內的10條副溶血性弧菌的irgB(鐵調節毒力監管蛋白基因)基因序列(genebank號分別為:CP013826.1、CP009982.1、CP011884.1、CP014046.1、CP006004.1、CP007004.1、CP003972.1、CP009765.1、CP020427.1、BA000031.2),通過DNAman比對分析副溶血性弧菌的保守序列,10條序列的同源性為99.27%。對保守序列按照RPA twist exo設計原則進行探針設計:RPA-exo熒光法探針長46～52 bp,在第30個堿基附近的兩個T堿基上分別用一個熒光報告基團(FAM-dT)和淬滅基團(BHQ-dT)取代該T堿基。在兩個T堿基之間添加一個脫堿基位點(dSpacer)取代所在位置堿基,探針5′端離dSpacer脫堿基位點至少30個堿基,3′端離dSpacer脫堿基位點至少15個堿基,同時3′端用C3-spacer修飾進行封閉。上下游引物以探針所在位置為基準,前后移動約5 bp堿基左右,依次構成相應的上游引物F1～F4,及下游引物R1～R4。將選定好的引物探針在NCBI上進行Blast以驗證其特異性。引物探針列表見表3,并交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表3 引物探針序列Table 3 Primer and probe sequence

1.2.2 DNA提取

1.2.2.1 標準菌株及分離菌株DNA提取 分別將標準菌株、實驗室分離菌株及惠贈菌株凍干粉接種至營養肉湯,37 ℃培養24 h,使用TAKARA細菌DNA提取試劑盒按說明書方法提取細菌DNA,-20 ℃保存備用。

1.2.2.2 檢測樣品增菌液DNA提取方法 檢測樣品按GB 4789.7-2013[10]進行取樣及預增菌操作而獲得增菌液;吸取1 mL增菌液于2.0 mL離心管中,12000 r/min離心3 min;棄上清,加入500 μL無菌ddH2O,混勻,12000 r/min離心3 min;重復洗滌一次;棄上清,加入100 μL ddH2O,混勻,100 ℃干浴10 min。12000 r/min離心3 min,取上清-20 ℃保存備用。

1.2.3 RPA反應體系及條件 將所合成引物探針稀釋成10 μmol/L工作液,按如下體系配成50 μL反應體系。其中先配成如下42.5 μL 預混液并混合均勻:Rehydration Buffer 29.5 μL,正反向引物(10 μmol/L)各2.1 μL,探針(10 μmol/L)0.6 μL,ddH2O 8.2 μL。向每管RPA酶干粉中加入上述42.5 μL預混液并溶解均勻,加入5 μL模板DNA。吸取2.5 μL 280 mmol/L MgAc于PCR管蓋上,蓋上蓋子后稍離心,迅速放入熒光PCR儀中進行RPA反應。T16等溫擴增儀反應條件:39 ℃,20 min,熒光收集FAM(17%)。

1.2.4 副溶血性弧菌RPA-exo引物探針的篩選及方法建立 以副溶血性弧菌CICC21617為DNA陽性模板,以ddH2O為空白對照,將所合成引物探針稀釋成10 μmol/L工作液后,分別以irgB1P1和irgB2P2為探針,組合對應的F1～F4,R1～R4引物進行最優引物探針對的篩選,反應體系及條件上機按照1.2.3。最優引物探針對為起峰時間早,熒光增加量大,引物探針對所對應空白對照無明顯起峰(熒光變化量<200)。以確定的最優引物探針組合,以副溶血性弧菌CICC21617 DNA為陽性對照模板,以ddH2O為空白對照模板,建立irgB副溶血性弧菌RPA-exo熒光探針法檢測體系,T16等溫擴增儀反應條件:39 ℃,15 min,熒光收集FAM(17%)。

1.2.5 特異性分析 將表1所列的標準菌株和表2實驗室分離及惠贈菌株按照1.2.2.1方法進行培養及DNA提取,使用1.2.4中篩選后確定的引物及探針進行RPA擴增,同時設置以ddH2O為模板的空白對照和以沙門氏菌CMCC(B)50115核酸為模板的陰性對照,以驗證方法的特異性。

1.2.6 靈敏度分析

1.2.6.1 基因組靈敏度分析 將副溶血弧菌CICC21617按照1.2.2.1進行培養及DNA提取并測得其濃度,同時將菌株培養液十倍稀釋鋪板于弧菌顯色培養基上,36 ℃過夜培養后進行菌落計數。將提取的DNA模板原液進行10倍梯度稀釋,將原液及DNA稀釋液作為DNA模板加入1.2.4建立的RPA-exo熒光探針法進行擴增,以有明顯熒光增加且增加值在300以上對應的最低濃度為檢出限,同時進行三次重復試驗[11]。

1.2.6.2 質粒靈敏度分析 將irgB質粒原液按10倍梯度稀釋至1 copies/μL,以各梯度稀釋液為模板按照1.2.4建立的RPA-exo熒光探針法擴增,以有明顯熒光增加且增加值在300以上對應的最低濃度為檢出限,同時進行三次重復試驗[12]。

1.2.7 模擬污染實驗 將副溶血性弧菌CICC21617接種于3% APW中,36 ℃過夜培養,取5 mL菌液8000 r/min離心5 min,棄上清后重懸于0.85%的生理鹽水中,并調濁度至1.0 MCF,取1 mL 1.0 MCF的濁度液進行十倍稀釋鋪板于弧菌顯色培養基中過夜培養,計算1.0 MCF濁度液中的原始菌落數。取25 g經國標GB 4789.7-2013確認無副溶血性弧菌污染的三文魚于225 mL 3%的APW中,將1 mL 1.0 MCF的濁度液梯度稀釋,并加入至3% APW樣品增菌液中,混合均勻后使樣品增菌液中副溶血性弧菌的終濃度約106、105、104、103、102、101cfu/mL,并于36 ℃培養0、2、4、6 h后,分別取1 mL增菌液按1.2.2.2提取DNA,并按1.2.4建立的RPA-exo熒光探針法進行檢測,同時設置以ddH2O為模板的空白對照和以沙門氏菌CMCC(B)50115核酸為模板的陰性對照[12]。

1.2.8 實際應用分析 檢測樣品每份平行取樣25 g,一份按照1.2.7模擬污染實驗中確定的最長增菌時間在APW中進行增菌,然后按照1.2.2.2提取樣品中的DNA,以1.2.4建立的RPA-exo熒光探針法檢測樣品中有無副溶血性弧菌的存在,并設置以ddH2O為模板的空白對照和以沙門氏菌CMCC(B)50115核酸為模板的陰性對照。同時,另一份按照國標GB 4789.7-2013增菌及檢測,生化實驗采用Vitek 2 compact和Vitek MS同時鑒定,以驗證RPA-exo熒光探針法和GB 4789.7-2013結果的一致性。

1.3 數據處理

本文1.2.3引物探針篩選,1.2.4irgB副溶血性弧菌RPA-exo熒光探針法建立體系,1.2.6 靈敏度分析的三次重復實驗的原始數據均由T16等溫擴增儀上導出,然后采用Excel 2010版進行線性擬合和繪圖。

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌RPA-exo引物探針的篩選及方法建立

以設計的探針為基礎,分別篩選相應的引物,效果如圖1。從圖1中可知,irgBP1的F3R3引物組合熒光變化量最大,達到2000的增量,起峰時間最短,且該引物探針對應的ddH2O為模板的空白對照無明顯起峰(熒光變化量<200)。進一步以irgBP1為探針,以F3為上游引物,分別R1、R2、R3、R4為下游引物;以R3為下游引物,分別以F1、F2、F4為上游引物,篩選最佳的探針引物對,篩選結果如圖2所示。從圖2可知,irgB1F3R1的起峰時間較其他引物組合起峰最早,起峰時間為3 min,反應最快,熒光增量最大,15 min后即達到平臺期,且空白對照無明顯起峰,因此,綜合熒光變化量及起峰時間,選定irgB1F3R1為最優的引物探針對組合,且檢測時間為15 min。以irgB1F3R1為引物探針,建立irgB1的RPA-exo熒光探針檢測體系,結果如圖3所示,irgB1F3R1引物探針對擴增的副溶血性弧菌CICC21617陽性對照熒光增量達到5000,起峰時間

圖2 irgB P1探針及引物篩選Fig.2 Screening of irgB P1 probes and primers注:1:irgb1F1R3;2:irgb1F3R1;3:irgb1F3R4;4:irgb1F3R3;5:irgb1F3R2;6:irgb1F2R3;7:irgb1F4R3;8～14:irgb1F1R3-、irgb1F3R1-、irgb1F3R4-、irgb1F3R3-、irgb1F3R2-、irgb1F2R3-、irgb1F4R3-;其中-表示該引物探針對應體系加入ddH2O模板作為空白對照,否則為加入副溶血性弧菌CICC21617DNA作為陽性對照。

圖1 irgB探針及引物篩選Fig.1 Screening of irgB probes and primers注:-表示該引物探針對應體系加入ddH2O模板作為空白對照,否則為加入副溶血性弧菌CICC21617DNA作為陽性對照。

圖3 irgB RPA-exo熒光探針法的建立Fig.3 Establishment of irgB RPA-exo fluorescence probe method

3 min,對應的空白對照無明顯起峰,15 min可獲得檢測結果。

2.2 特異性實驗結果

利用所建立的副溶血性弧菌irgBRPA-exo熒光探針法分析,按照1.2.5特異性實驗方法進行檢測,結果見表4。從特異性實驗結果可知,建立的irgBRPA-exo熒光探針法特異良好,僅能檢出副溶血性弧菌,其他非副溶血性弧菌均未被檢出,與其親緣關系的弧菌屬的溶藻弧菌、創傷弧菌、創傷弧菌、霍亂弧菌、弗尼斯(氏)弧菌、美人魚發光桿菌美人魚亞種、魔鬼弧菌、需鈉弧菌、哈氏弧菌、坎氏弧菌、氣單胞菌屬無交叉反應。

2.3 靈敏度實驗結果

2.3.1 基因組靈敏度分析 按照1.2.6.1方法,1 mL副溶血性弧菌CICC21617過夜培養菌液計數菌落數為1.0×108CFU/mL,提取1 mL該菌液的基因組DNA濃度為35 ng/μL。分析irgBRPA-exo熒光探針法的基因組靈敏度,結果如圖4所示,irgBRPA-exo熒光探針法的靈敏度為1.0×103CFU/mL,DNA檢測限為0.35 pg/μL。

圖4 irgB RPA-exo熒光探針法基因組靈敏度分析Fig.4 Genome sensitivity analysis of irgB RPA-exo注:1:1.0×108 CFU/mL;2:1.0×107 CFU/mL;3:1.0×106 CFU/mL;4:1.0×105 CFU/mL;5:1.0×104 CFU/mL;6:1.0×103 CFU/mL;7:1.0×102 CFU/mL;8:1.0×101 CFU/mL;9:空白對照。

2.3.2 質粒靈敏度分析 將irgB序列合成質粒,濃度為9.7×1010copies/μL,加無菌水調整至1×1010copies/μL,按照1.2.6.2方法檢測質粒檢出限。檢測結果如圖5所示,由圖5可知,irgBRPA-exo熒光探針法質粒靈敏度為1×103copies/μL。

表4 irgB RPA-exo特異性分析結果Table 4 Specificity analysis results of irgB RPA-exo

圖5 irgB RPA-exo熒光探針法質粒靈敏度分析Fig.5 Plasmid sensitivity analysis of irgB RPA-exo注:1:1×106 copies/μL;2:1×105 copies/μL;3:1×104 copies/μL;4:1×103 copies/μL;5:1×102 copies/μL;6:1×101 copies/μL;7:1 copies/μL;8:空白對照。

注:“+”代表陽性結果,“-”代表陰性結果。

2.4 模擬污染實驗結果

模擬污染實驗中副溶血性弧菌CICC21617通過離心重懸調為1.0 MCF,于弧菌顯色平板計數為3.4×109CFU/mL,稀釋104、105、106、107后加入1 mL對應副溶血性弧菌稀釋液于250 mL樣品增菌液中,對應的終濃度分別為:1.36×103、1.36×102、1.36×101、1.36 CFU/mL,采用建立的irgBRPA-exo熒光探針法在T16等溫擴增儀上測定36 ℃培養0、2、4、6、8 h的結果,匯總如表5所示。當三文魚樣品中加入副溶血性弧菌終濃度為1.36×103CFU/mL時,無需增菌即可被檢出,增菌6 h時,樣品所有梯度均可被檢出(終濃度為1.36×102、1.36×101、1.36 CFU/mL)。雖然當樣品含菌量達到1.36×103CFU/mL時無需增菌即可被檢出,為防止漏檢,確定最長增菌時間為6 h。

表5 模擬污染實驗結果Table 5 Experimental results of simulated contamination experiment

注:“+”表示irgBRPA-exo檢測陽性,“-”表示irgBRPA-exo檢測陰性。

2.5 實際應用分析

10份水產品經過6 h的3% APW增菌后,RPA檢測結果與國標GB 4789.7-2013 檢測結果如表6所示。

表6 實際樣品分析結果Table 6 Analysis results of actual samples

由表6結果可知,irgBRPA-exo和GB 4789.7-2013檢測結果一致,10份樣品中,有3份被檢出。

3 結論與討論

為將食品和環境中的致病性和非致病性副溶血性弧菌一次檢出,且與國標GB 4789.7-2013的結果保持一致,本研究在國內首次建立了副溶血性弧菌irgB的RPA-exo熒光探針檢測方法。該方法特異性高,與副溶血性弧菌親緣關系較近的弧菌屬溶藻弧菌、創傷弧菌、創傷弧菌、霍亂弧菌、弗尼斯(氏)弧菌、美人魚發光桿菌美人魚亞種、魔鬼弧菌、需納弧菌、哈氏弧菌、坎氏弧菌、氣單胞菌屬無交叉反應,與其它非弧菌也無交叉反應;靈敏度為1.0×103CFU/mL,DNA檢測限為0.35 pg/μL,質粒檢測限為1×103copies/μL,顯示了較高的靈敏度;模擬污染實驗中,當三文魚樣品中加入副溶血性弧菌終濃度為1.36×103CFU/mL時,無需增菌即可被檢出,增菌6 h時,樣品所有加標梯度均可被檢出;將該方法應用到實際樣品檢測中,發現購買的10份水產品,有3份樣品被檢出,檢測結果與國標的檢測結果一致。

RPA檢測方法作為分子生物學的分支,靶基因的選擇方法特異性的關鍵。目前,基于核酸檢測副溶血性弧菌的大部分文獻以16S rRNA、tlh(不耐熱相關溶血素)、gyrB(DNA旋轉酶B亞基)、toxR(霍亂毒素的調控子及其他基因的調控子)、pR72H、collagenase(膠原酶基因)等靶標基因來檢測[9,13-15],但研究發現上述基因均存在假陽性的問題[16-19]。Yu等[9]通過比較基因組學方法發現,irgB基因可作為檢測副溶血性弧菌的新靶標基因,以irgB設計PCR引物,對293株副溶血性弧菌、11株弧菌和35株非弧菌進行檢測,發現其特異高,僅可檢測出副溶血性弧菌,其無漏檢,靈敏度為0.17 pg基因組DNA。通過本研究的數據同樣證明,irgB為靶基因建立的方法特異性和靈敏度高,而將RPA-exo方法與特異性靶標基因irgB結合,可在3 min起峰,15 min熒光增量達到平臺期,獲得檢測結果,檢測速度高效,且操作簡單,適合應用于快速檢測中。