響應面優化紫果西番蓮維生素C的超聲輔助提取工藝

賀銀菊,2,楊再波,2,彭莘媚,2,楊 艷,彭召旭

(1.黔南民族師范學院化學化工學院,貴州都勻 558000; 2.貴州省高校民族藥用植物資源開發工程研究中心,貴州都勻 558000)

西番蓮(Passion fruit)又稱巴西果、雞蛋果、熱情果,是西番蓮科多年木質藤本植物果實的通稱,氣味芳香濃郁,有“果汁之王”的美譽[1]。目前西番蓮主要有黃果、紫果、紫紅色果三個品種,其果實均由果皮和果肉兩部分組成,果肉呈黃色、味酸,含有豐富的蛋白質、還原糖、礦物質元素、A族/B族維生素、胡蘿卜素、有機酸、人體所需要的氨基酸及維生素C,豐富有機酸的存在使維生素C不易受到損失。因此西番蓮果是維生素C的良好來源,被譽為水果中的維生素C之王[2-4]。

維生素C是維持機體正常的生命活動所必須的一種物質,可促進膠原蛋白合成,組織修補,葉酸的代謝,參與機體的解毒、膽固醇代謝、預防多種疾病;同時還具有抗氧化、抗腫瘤、抗自由基等功效[5-9]。維生素C有較強的還原性,在空氣中易被氧化,弱酸提取可以增強提取液中維生素C的穩定性,常用醋酸、草酸、鹽酸、偏磷酸、混酸等[10-13]提取果蔬中的維生素C,酸濃度對維生素C的提取量有一定的影響[14]。常見的維生素C的測定方法主要有滴定法、電化學法、光譜法和色譜法等[15],主要提取方法有水提法、酸提取法、醇提取法、超聲輔助提取法微波提取法等[16-19],其中超聲輔助法可縮短提取時間、提高提取率。

目前對紫果西番蓮果肉維生素C提取工藝的報道較少,本文以紫果西番蓮為研究對象,考察不同酸提取劑對其果肉中維生素C提取量的影響;在最佳酸提取劑的條件下,用超聲輔助技術考察液料比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率對維生素C提取的影響,結合單因素試驗結果設計響應面優化試驗確定紫果西番蓮果肉維生素C的最佳工藝,為進一步開發紫果西番蓮的價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫果西番蓮 2018年11月采于貴州省平塘縣塘邊鎮新街村,成熟后采摘,去皮取其果肉備用;維生素C標準品 中國食品藥品檢定研究院;草酸、鹽酸 均為分析純。

DZ-2A型真空干燥箱、SHZ-D循環水真空泵 鄭州英峪予華儀器有限公司;BS1105電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;FA2204電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TU-1901型雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫果西番蓮維生素C提取工藝 取成熟的紫果西番蓮可食果肉部分5.00 g,按照一定的液料比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 mL/g)加入2%草酸提取劑,在一定的提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)和提取功率(200、250、300、350、400 W)下提取一定的時間(5、10、15、20、25 min),然后過濾定容,在最佳吸收波長處測定樣品的吸光度值,得出紫果西番蓮果肉中維生素C的含量。

1.2.2 提取溶劑的選擇 在液料比為4∶1 mL/g、超聲溫度為40 ℃、超聲時間15 min及超聲功率300 W下研究1%草酸、1%鹽酸、2%草酸、1%草酸+1%鹽酸(體積比1∶1)和2%鹽酸等對紫果西番蓮果肉維生素C提取量的影響,通過測定比較5種酸提取劑提取液中的維生素C含量得出最佳的提取溶劑,在最佳酸提取劑的條件下采用單因素試驗和響應面優化實驗優化維生素C提取工藝。

1.2.3 單因素實驗 紫果西番蓮提取的基本條件為:液料比4∶1 mL/g,超聲溫度40 ℃,超聲時間15 min,超聲功率300 W,改變其中一個條件,分別考察液料比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 mL/g)、超聲溫度(20、30、40、50、60 ℃)、超聲時間(5、10、15、20、25 min)和超聲功率(200、250、300、350、400 W)對紫果西番蓮提取液維生素C含量的影響。

1.2.4 響應面試驗 根據單因素試驗結果,運用Box-Benhnken中心組合原理,設計響應面優化試驗,其因素及水平見表1。根據響應面優化設計試驗結果進行驗證性試驗,計算紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of response surface methodology

1.2.5 維生素C含量的測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制 準確稱取0.2500 g維生素C標準品于燒杯中,用2%草酸的溶解轉入250 mL容量瓶中,定容,混勻,即得1 mg/mL維生素C標準溶液備用。移液器分別準確吸取1 mg/mL維生素C標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5個潔凈干燥的10 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,配制成濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的維生素C的標準溶液。以蒸餾水為參比,在最佳吸收波長270 nm處測定吸光度值,以維生素C濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5.2 樣品維生素C含量的測定 稱取5.00 g紫果西番蓮果肉,以1.2.2中的最佳酸2%草酸作提取劑。按照單因素和響應面優化條件提取紫果西番蓮的維生素C,提取完成后蒸餾水定容至50 mL,以蒸餾水為參比,在270 nm處測定吸光度值,計算維生素C含量。

1.3 數據處理

標準曲線、酸提取劑影響及單因素試驗數據處理采用Origin 8.0軟件作圖,響應面優化分析及方差分析采用Design-Expert V 8.0.6軟件,P<0.05表明差異顯著。

2 結果與分析

2.1 維生素C的標準曲線

根據1.2.5.1標準樣品的吸光度值和濃度,繪制標準曲線,結果如圖1,由圖1可知，維生素C標準樣品在20～100 μg/mL范圍內吸光度與濃度呈良好的線性關系,回歸方程y=0.00909x+0.05219,R2=0.99967。

圖1 維生素C的標準曲線Fig.1 Standard curve of vitamin C

2.2 不同酸提取溶劑對提取液中維生素C含量的影響

不同酸對紫果西番蓮果肉維生素C提取量的影響,結果見圖2,由圖2可知,提取溶劑為2%草酸溶液時,維生素C提取量最高,這是因為不同酸提取溶劑對維生素C有一定的影響[14],且紫果西番蓮果肉中含有一定的有機酸[2],當提取溶劑為2%草酸時維生素C提取量最高,因此單因素和響應面優化均選擇2%草酸溶液作提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對紫果西番蓮 提取液維生素C含量的影響Fig.2 Effects of different kinds of extraction solvent on content of vitamin C in the purple passion fruit extract

2.3 單因素實驗

2.3.1 液料比對提取液中維生素C含量的影響 液料比對提取液中維生素C含量的影響見圖3,由圖3可見,液料比對紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量影響較大,當液料比為4∶1 mL/g時紫果西番蓮果肉中提取液中維生素C含量最高,在2∶1～4∶1 mL/g時隨著液料比的增大,提取液中維生素C含量升高;在4∶1～6∶1 mL/g時隨著液料比的增大,提取液中維生素C含量降低。這是因為隨著液料比的增加有利于維生素C的浸出,維生素C含量升高;而液料比過高時影響浸提體系的果肉介質的傳熱等,提取液中維生素C含量降低。因此選擇液料比3∶1、4∶1、5∶1 mL/g作為響應面設計的3個水平。

圖3 液料比對紫果西番蓮提取液中維生素C含量的影響Fig.3 Effect of material to solvent ratio on vitamin C content in the purple passion fruit extract

2.3.2 超聲溫度對提取液中維生素C含量的影響 超聲溫度對提取液中維生素C含量的影響見圖4,由圖4可見，超聲溫度對紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量影響較大,當超聲溫度為40 ℃時紫果西番蓮果肉中提取液中維生素C含量最高,在20～40 ℃時隨著超聲溫度的升高,提取液中維生素C含量升高;在40～60 ℃時隨著超聲溫度的升高,提取液中維生素C含量降低。這是因為隨著超聲溫度的升高加快分子的運動速率有利于維生素C的浸出,維生素C含量升高;而超聲溫度過高時使維生素C分解甚至氧化,維生素C的提取量降低[20]。因此選擇提取溫度35、40、45 ℃作為響應面設計的3個水平。

圖4 超聲溫度對紫果西番蓮 提取液中維生素C含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on vitamin C content in the purple passion fruit extract

2.3.3 超聲時間對提取液中維生素C含量的影響 超聲時間對提取液中維生素C含量的影響見圖5,由圖5可見,超聲時間對紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量影響較大,當超聲時間為20 min時紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量最高,在5～20 min時隨著超聲時間的增加,提取液中維生素C含量升高;在20～25 min隨著超聲時間的增加,提取液中維生素C含量降低。這是因為隨著超聲時間的增加維生素C的提取量積累,維生素C的提取量升高;而超聲時間過長時使維生素C氧化分解,維生素C的提取量降低[20]。因此選擇提取時間15、20、25 min作為響應面設計的3個水平。

圖5 超聲時間對紫果西番蓮 提取液中維生素C含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on vitamin C content in the purple passionfruit extract

2.3.4 超聲功率對提取液中維生素C含量的影響 超聲功率對提取液中維生素C含量的影響見圖6,由圖6可見,超聲功率對紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量影響較大,當超聲功率為300 W時紫果西番蓮果肉中維生素C提取量最高,在200～300 W時隨著超聲功率的增加,提取液中維生素C含量升高;在300～400 W時隨著超聲功率的增大,提取液中維生素C含量降低。這是因為隨著超聲功率的增加超聲波破壞細胞壁的速率增加,維生素C的提取量升高;而超聲功率過高時破壞了果肉分子的結構,維生素C的提取量降低。因此最佳超聲功率為300 W,選擇250、300、350 W作為響應面設計的3個水平。

圖6 超聲功率對紫果西番蓮 提取液中維生素C含量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on vitamin C content in the purple passionfruit extract

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗結果 根據Box-Benhnken的中心組合設計原理,設計了4因素3水平的29組試驗優化紫果西番蓮果肉中維生素C的提取工藝,維生素C提取優化試驗數據見表2,根據表2的數據用軟件Design-Expert 8.0.6進行擬合、分析,得維生素C含量Y的回歸方程:

Y(mg·g-1)=0.52-0.0029A+0.047B-0.0066C+0.014D-0.0078AB+0.0043AC-0.0062AD+0.0088BC-0.018BD-0.0071CD-0.013A2-0.040 B2-0.0048C2-0.034D2。

表2 響應面設計試驗設計及結果Table 2 Arrangement and results of response surface methodology

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of model

注:**表示差異極顯著(P<0.01),*表示差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 響應面分析 兩兩因素的交互作用響應面見圖7,由圖7可知,因素間相互作用對紫果西番蓮果肉中提取液中維生素C含量的影響,即響應面對各因素的敏感程度反映了在另外兩個因素固定的條件下,兩兩因素對提取液中維生素C含量影響。響應面坡面越陡峭表明響應面受實驗因素變化就越大,響應面坡面越平緩表明響應面受實驗因素變化就越小。由圖7可見,兩兩因素交互響應面坡面陡峭順序為:BD>BC>AB>CD>AD>AC,即超聲溫度和超聲功率的交互作用響應面最陡峭,說明超聲溫度和超聲功率的交互作用對維生素C提取量影響最大,而液料比和超聲時間的交互作用響應面最平緩,說明液料比和超聲時間的交互作用對維生素C提取量影響最小。

圖7 各因素兩兩交互作用對紫果西番蓮提取液中維生素C含量的響應面Fig.7 Response surface of the effect interaction between two factors of vitamin C from the purple passionfruit

2.4.3 響應面試驗優化及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件,對回歸模型進行預測得到紫果西番蓮果肉維生素C含量提取最佳工藝為:液料比3.62∶1 mL/g、超聲溫度42.66 ℃、超聲時間17.59 min和超聲功率 307.24 W,維生素C理論含量為0.5337 mg/g。根據預測條件和實際操作設計維生素C提取條件分別為:液料比4∶1 mL·g-1、超聲溫度43 ℃、超聲時間18 min和超聲功率310 W,進行3次平行試驗取實驗的平均值,得紫果西番蓮果肉中提取液中維生素C含量為0.5316 mg/g,預測結果和實測結果相近,說明擬合良好、參數可靠。

3 結論

本文首先研究了不同濃度的酸提取劑對紫果西番蓮果肉提取液中維生素C含量的影響,得出2%的草酸作提取劑時,提取液中維生素C含量最高,分析原因主要是紫果西番蓮果肉中本身就存在大量的有機酸。響應面優化結果表明:二次模型極顯著,準確性較高;回歸方程和各因素交互作用響應面表明各因素對紫果西番蓮果肉中維生素C提取量的影響順序為B>D>C>A,即超聲溫度影響最大,超聲功率次之,再次是超聲時間的影響,液料比的影響最小。根據回歸模型進行預測和驗證性實驗,建立了維生素C提取的最佳工藝:液料比4∶1 mL·g-1、超聲溫度43 ℃、超聲時間18 min和超聲功率310 W,紫果西番蓮果肉中的維生素C含量為0.5316 mg/g。可見紫果西番蓮果肉中含有豐富的維生素C,不愧為水果中的維生素C之王。