超聲輔助酶法提取薰衣草花色苷及其熱降解動力學

(昌吉學院,化學與應用化學系,新疆昌吉 831100)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)為唇形科多年生的亞灌木植物,擁有濃烈的香氣,故有“芳香之王”的美譽[1],主要分布于新疆、云南等地,其葉、莖、花全株呈濃香,香味濃郁而柔和、無刺激感、無毒副作用,被廣泛地應用于醫藥[2]、化妝[3]、洗滌、食品行業[4]。薰衣草含有甾醇類、有機酸類、苷類等多種生物活性成分[5]。花色苷是一種具有糖苷鍵的生物類黃酮,廣泛存在于色澤鮮艷的植物中,具有抗氧化[6]、抗菌消炎[7]、抗腫瘤[8]、保護心腦血管[9]以及緩解視疲勞[10]等功效,特別是其具有安全性高以及資源可再生等特點而成為研究的熱點。傳統的花色苷提取方法主要有溶劑萃取法[11]、超聲輔助法[12]、微波輔助法[13]、超高壓法[14]和生物酶法[15]等。目前有關薰衣草主要集中在化學成分[5]和精油提取[16]方面的研究,最近學者研究了薰衣草中黃酮的提取,但是采用超聲輔助酶法提取薰衣草花色苷的研究鮮見報道[12]。

熱處理是食品加工過程中最普遍和有效的殺菌方式,但高溫處理可能會引起花色苷發生降解,甚至導致褐變。因此,利用化學動力學原理研究花色苷熱降解動力學規律,對確定提高花色苷穩定性的措施和拓展其應用范圍極為重要。近年來,國內外許多學者對花色苷熱降解動力學進行了研究,騰飛等[17]研究了不同pH和溫度下龍葵果花色苷的熱降解規律,曹少謙等[18]研究了桑葚花色苷熱降解動力學,李恩惠等[19]研究了在不同pH下藍莓花色苷的花色苷熱降解動力學,這些研究表明花色苷的熱降解動力學模型符合一級反應動力學方程。然而,以上報道均使用花色苷粗提物進行降解研究。花色苷粗提物中含有糖、有機酸及黃酮類等雜質,這些雜質對花色苷降解機理有一定的影響,而純花色苷的降解機制研究尚無報道。

基于此,本文以新疆伊犁薰衣草花色苷為研究對象,采用響應曲面法優化超聲輔助酶法提取薰衣草中花色苷,通過Box-Behnken設計試驗結合響應面分析法優化提取工藝條件,并對薰衣草花色苷進行分離純化,探討在不同pH和溫度對純薰衣草花色苷的熱穩定性影響,進而建立其熱降解動力學模型,以期為薰衣草花色苷的資源開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薰衣草花穗 2018年6月購自新疆伊犁霍城縣;果膠酶(30000 U/g) 天津市利華酶制劑技術有限公司;乙醇、鹽酸、冰醋酸、醋酸鈉、氯化鉀 均為分析純,阿拉丁化學試劑有限公司。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司;XO-2B型超聲波提取器 南京先歐儀器制造有限公司;DK29821型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-1002旋轉蒸發器 西安禾普生物科技有限公司;pH510酸度計 安萊立斯儀器科技(上海)有限公司;SHZ-2000循環水式真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠;800B型離心機 上海安亭科學儀器廠制造;MiLLROCK冷凍干燥機 美國Commillrock公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薰衣草花色苷的提取 準確稱取干燥的薰衣草花穗2.000 g,依次加入10.0 mL pH為3的醋酸鈉緩沖溶液、0.20%的果膠酶,充分混合,在40 ℃水浴中酶解反應60 min;然后加入無水乙醇使其反應體系濃度為80%,繼續在同樣溫度條件下超聲(800 W)提取30 min,于4000 r/min離心15 min,取上清液得到薰衣草花色苷提取物并進行含量測定。

1.2.2 花色苷的測定 花色苷含量采用pH示差法進行測定[12]。將一定量上清液轉移至25 mL容量瓶內,用無水乙醇定容,再分別用pH1.0和pH4.5緩沖液稀釋n倍,混勻后,放入40 ℃水浴中靜置平衡30 min。對照組將乙醇用pH1.0和pH4.5緩沖液稀釋n倍,混合均勻后放入40 ℃水浴中平衡30 min,平衡結束后,測其在最大吸收波長545和700 nm處的吸光度。按式(1)計算薰衣草花色苷的相對含量:

花色苷的質量濃度c(mg·mL-1)=[(A545-A700)pH1.0-(A545-A700)pH4.5]× n×M/εb

式(1)

式中:n為稀釋倍數;M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量445.2 g/mol;ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數,29600;b為比色皿厚度cm。

花色苷得率為:

花色苷得率(%)=提取液中花色苷的質量/薰衣草質量×100

式中:薰衣草質量,g;提取液中花色苷的質量,g。

1.2.3 單因素實驗 按照1.2.1中花色苷提取方法,分別考察加酶量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)、乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、酶解時間(30、60、90、120、150 min)、酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)、超聲提取時間(10、15、20、25、30 min)和酶解pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)等6個因素對薰衣草花色苷得率的影響。單因素變化時,確定乙醇濃度80%、酶解時間60 min、酶解溫度40 ℃、超聲提取時間30 min和酶解pH 3等因素不變。每個單因素實驗平行重復3次,結果取平均值。

1.2.4 響應面試驗設計 以單因素實驗為基礎,選取對花色苷提取影響較大的超聲時間、乙醇濃度、酶解溫度和酶解時間四個因素為變量,花色苷得率為響應值,采用Box-Benhnken設計響應面試驗,各因素水平見表1。

表1 超聲波提取薰衣草花色苷的響應面分析因素與水平表Table 1 The experimental factors and levelsTable of response surface analysis

1.2.5 薰衣草花色苷的純化 按照1.2.4節中優化工藝提取薰衣草花色苷粗提液,上清液經濃縮、用石油醚萃取、水相通過D-101大孔吸附樹脂吸附純化、用酸化的乙醇溶液洗脫,洗脫液再濃縮、冷凍干燥,得到粉末,低溫下保存,備用[20]。

1.2.6 不同pH薰衣草花色苷溶液的熱穩定性 稱取一定量的薰衣草花色苷凍干粉,配制成360.5 mg/L的花色苷溶液。在花色苷溶液中,分別加入緩沖溶液,調節溶液的pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,再分別置于50、60、70、80 ℃水浴中避光保溫6 h。在各溫度條件下,每隔1 h取樣1次,取樣后,放入冰水中急速冷卻待測液至室溫,測定其花色苷含量,平行實驗3次,取其平均值。

1.2.7 不同pH下花色苷熱降解動力學研究 大多數研究表明,花色苷降解遵循一級反應動力學模式。假定薰衣草花色苷的熱降解反應也符合零級、一級、二級或三級反應動力學。

花色苷殘留率(%)=(Ct/C0)×100

式(1)

即花色苷殘留率(%)=(At/A0)×100

式(2)

式中,Ct、C0、At、A0為熱處理后和處理前花色苷含量、吸光度。

根據花色苷殘留率,按以下公式計算零級、一級、二級或三級動力學反應的速率常數(k)。

零級動力學方程:Ct-C0=-kt

式(3)

一級動力學方程:lnCt/C0=lnAt/A0=-kt

式(4)

二級動力學方程:1/Ct-1/C0=-kt

式(5)

式(6)

式中,t為熱處理時間(h),k0、k1、k2、k3分別為零級、一級、二級、三級速率常數,min-1。

薰衣草花色苷降解的半衰期t1/2(h)由(7)式計算:

t1/2=ln2/k

式(7)

溫度系數Q10由(8)式計算:

式(8)

式中,Q10表示溫度每升高10 ℃,反應速率增大的比例數;k1和k2分別為溫度t1和t2時的一級反應速率常數。

薰衣草花色苷降解90%所需時間D(h)由(9)式計算:

D=-ln10/t

式(9)

式中,k為T ℃下的降解速率。

薰衣草花色苷的半衰期(t1/2)變化10倍所需的溫度變化Z由(10)式計算:

T=-Z lgt1/2+b

式(10)

式中,b為線性方程提供的截距。

花色苷熱降解活化能(Ea)根據Arrhenius方程由(11)、焓變(ΔH,kJ/mol)由(12)式計算:

lnk=lnk0-Ea/RT

式(11)

ΔH=Ea-RT

式(12)

式中,R為氣體常數,8.314 kJ/(mol·K);k0為頻率常數,min-1;T為絕對溫度(K)。

1.3 數據處理

使用Origin 8.0處理實驗數據,采用Design Expert V 8.0.6.1軟件進行二次回歸擬合以及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 果膠酶添加量對薰衣草花色苷得率的影響 由圖1可知,隨著果膠酶量的增加,花色苷得率呈現先逐漸升高,然后基本保持平穩,最后呈緩慢降低的趨勢。這可能由于底物細胞壁含有果膠,隨著果膠酶量的增加時,能夠促進果膠物質的水解和溶質擴散,有利于花色苷溶出;當果膠酶添加量在0.10%～0.20%范圍內時,酶濃度趨于飽和,細胞壁的降解較徹底;而過量的果膠酶,不僅會抑制酶的活性,而且會水解花色苷中糖苷鍵,破壞花色苷結構[15,21],進而影響提取效果。考慮到經濟性,故選擇0.10%為最佳加酶量。

圖1 加酶量對花色苷得率的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage on anthocyanins yield

2.1.2 乙醇濃度對薰衣草花色苷得率的影響 由圖2可知,在一定范圍內,花色苷得率隨著乙醇濃度的增大而增大,當乙醇濃度為50%時,花色苷提取效果最佳;繼續增加乙醇濃度,花色苷得率反而逐漸下降。這可能是因為隨著乙醇濃度的增加,溶劑的滲透力增強,有利于花色苷的釋放。繼續增大乙醇濃度,不僅使得溶液的極性降低,導致極性花色苷糖苷溶解度下降,還使得一些醇溶性雜質以及親脂類物質的溶出量增加,從而與花色苷形成競爭,不利于花色苷的溶出,同時增加了后續工藝難度,故乙醇濃度選擇40%～60%為宜。

圖2 不同乙醇濃度對花色苷得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on anthocyanins yield

2.1.3 酶解時間對薰衣草花色苷得率的影響 由圖3可知,隨著酶解時間的延長,花色苷得率迅速升高;當酶解時間60 min時,提取效果最好,花色苷得率達5.83%;當繼續延長酶解時間,花色苷得率反而有所降低,這可能是因為酶解時間為60 min時,酶解反應基本完成;繼續延長酶解反應時間不僅會使花色苷發生氧化,導致花色苷分子結構部分分解而被破壞,還使得其它非花色苷成分大量溶出,從而導致花色苷得率反而降低,且增加了能耗,不利于工業生產。故選擇50～70 min為宜。

圖3 酶解時間對花色苷得率的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time on anthocyanins yield

2.1.4 酶解溫度對薰衣草花色苷得率的影響 由圖4可知,花色苷得率隨著酶解溫度的升高呈現先升高后下降的趨勢。當酶解溫度為50 ℃時,花色苷得率最高,說明酶達到活性最強。這可能是在低溫度下,酶的活性沒有有效的發揮作用,隨著溫度升高,溶液體系的熱能增加,促進酶分子和活性物質分子的滲透、擴散和溶解,加快分子運動速度,同時增強酶的活性,促進酶解反應加速,使得花色苷更易釋放到溶劑中;但溫度過高,使酶的穩定性降低,甚至高溫會破壞酶的結構,減弱或抑制酶的活性,導致酶解速率降低。另外,溫度升高,花色苷易發生氧化或分解,使得穩定性降低,從而使得率下降。故選擇40～60 ℃為宜。

圖4 酶解溫度對花色苷得率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on anthocyanins yield

2.1.5 超聲提取時間對薰衣草花色苷得率的影響 由圖5可知,隨著超聲提取時間的延長,花色苷得率呈先逐漸升高后略下降的趨勢,超聲時間為25 min 時,花色苷得率達到最大,說明大部分花色苷已從組織中溶出,體系內花色苷濃度達到動態平衡;繼續延長時間,花色苷得率略有降低,這可能是因為隨著超聲提取時間的延長,花色苷在空化作用下加劇被氧化降解從而破壞花色苷結構和穩定性,導致花色苷得率略有下降。因此超聲提取時間在20～30 min為宜。

圖5 超聲時間對花色苷得率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic-assisted extraction time on anthocyanins yield

2.1.6 pH對薰衣草花色苷得率的影響 由圖6可知,當pH在2～3之間,隨著pH的升高,花色苷得率逐漸增大;pH在3時,花色苷得率達到最高;當pH大于3時,花色苷得率反而逐漸降低。這說明pH為3左右是該體系中酶解反應的最適pH,在此條件下,果膠酶的活性最高,酶解反應效果最佳,且花色苷在酸性環境中穩定存在,故選擇pH3為宜。

圖6 pH對花色苷得率的影響Fig.6 Effects of pH on anthocyanins yield

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面回歸模型的建立與分析 提取薰衣草花色苷的響應面試驗設計方案與結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface experiment

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the developed regression model

注:P<0.0010表示該指標非常顯著,**;P<0.0500表示該指標顯著,*;P>0.0500表示該指標不顯著。

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗數據進行回歸擬合,得到薰衣草花色苷得率對4個自變量因子的二次多元回歸方程模型為:花色苷得率Y=6.15+0.13A-0.031B+0.14C+0.58D+0.034AB-0.34AC-0.60AD-0.011BC+0.25BD-0.79CD-1.17A2-1.09B2-1.18C2-1.42D2,此方程中各項系數的絕對值大小反映了各因子對響應值的影響程度。

由回歸方程系數顯著性檢驗可知,該模型的一次項D、交互項AC、AD、CD和平方項A2、B2、C2、D2對花色苷得率的影響極顯著(P<0.01),一次項A、C和交互項BD對花色苷得率的影響顯著(P<0.05),其他項不顯著,表明各因素對花色苷得率的影響不同。從F值可知,各因素對花色苷得率影響的顯著性大小順序為酶解時間>酶解溫度>超聲時間>乙醇濃度。

2.2.2 響應面分析 為了進一步確定各因素間的交互作用對響應值的影響,利用Design Expert-V8.0.6.1軟件中響應面圖對回歸方程進行分析,結果見圖7。

根據響應面圖中曲線陡峭程度和等高線形狀,可以直觀地反映出各因素交互作用對響應值影響的顯著性。由圖7可知,交互項超聲時間與酶解溫度AC、超聲時間與酶解時間AD、乙醇濃度與酶解時間BD和酶解溫度與酶解時間CD對花色苷得率的曲線非常陡峭,等高線呈橢圓形,表明其交互作用顯著;交互項超聲時間與乙醇濃度AB和乙醇濃度與酶解溫度BC對花色苷得率的曲線較平緩,且等高線圖呈圓形,表明其交互作用不顯著,但其對花色苷得率存在一定的影響,這與前面方差分析結果一致。

2.2.3 最佳工藝的確定與驗證實驗 在加酶量0.15%和pH為3的最佳單因素試驗結果基礎上,通過Design Expert V8.0.6.1軟件對回歸模型進行最優化分析,得到超聲波輔助酶法提取薰衣草花色苷的最佳工藝條件為濃度50.1%乙醇溶液作為提取劑、酶解溫度為49.88 ℃、酶解時間62.08 min、超聲時間25.01 min,在此條件下,預期花色苷得率可達到6.21%。考慮到實際試驗條件的可操作性,將最佳工藝條件修正為乙醇濃度50%、酶解溫度50 ℃、酶解時間62 min、超聲時間25 min,在此條件下進行3次重復驗證實驗,薰衣草花色苷平均得率為6.22%。實際值與理論預測值非常接近,其相對誤差約為0.16%,可以說明該數學模型可靠,采用響應面分析法優化超聲輔助酶法提取薰衣草花色苷的工藝是可行的。

圖7 各因素交互作用的響應面圖Fig.7 Response surface of the interactive effects of various factors

圖8 在不同pH下花色苷的熱穩定性Fig.8 Thermal stability of anthocyanins at different pH values

2.3 不同pH薰衣草花色苷溶液的熱穩定性

如圖8所示,隨時間變化,花色苷含量呈現一定的規律:溫度越高,花色苷降解越快,穩定性越差;在相同pH條件下的花色苷隨加熱時間和溫度的變化出現不同程度降解。80 ℃時,花色苷的降解明顯比其他溫度下降解速率快,花色苷濃度變化明顯,說明花色苷損失較大;花色苷在低pH、低溫情況下,穩定性較好。通過直接觀察現象,花色苷受溫度的影響,顏色變化較大,特別是在高溫情況下尤為明顯,而在低溫下,顏色持久鮮艷。

表4 不同pH下薰衣草花色苷溶液的動力學參數Table 4 Kinetic parameters of lavender anthocyanin solution under different pH values

同樣,薰衣草花色苷穩定性受pH的影響很大。在相同溫度下,隨pH的增加,花色苷濃度降低,殘留值變少,這也與早期文獻報道相符[22],可能是pH小于3.0時,薰衣草花色苷主要以2-苯基苯并吡喃陽離子的形式存在,隨著pH升高,薰衣草花色苷逐漸轉變為不穩定的查爾酮結構,因此薰衣草花色苷在酸性環境中,穩定性更強。

2.4 不同pH下薰衣草花色苷熱降解動力學研究

為了進一步了解薰衣草花色苷降解過程,對花色苷進行動力學研究。根據Arrhenius公式擬合線性回歸分析,由不同溫度和pH下,-ln(Ct/C0)與時間做圖(見圖8)得速率常數(k),線性回歸曲線相關系數R2均大于0.9(見表4)。由速率常數k的大小和R2值確定薰衣草花色苷降解反應符合一級反應動力學反應,這與不同花色苷來源如玫瑰[23]、藍莓[19]、玫瑰茄[24]、桑葚[18]中的花色苷降解動力學結果相似。

如表4所示,不同pH條件下,薰衣草花色苷熱降解速率K(h-1)和半衰期T1/2(h)受加熱溫度的影響。花色苷熱降解速率K(h-1)隨溫度的升高而加快,同時伴隨著半衰期T1/2(h)減少。花色苷在pH為1時Ea最大且Z值最小,表明花色苷在pH為1時發生熱降解需要的能量最高,熱穩定性好。pH為6時Ea最小且Z值最大,熱穩定性最差,花色苷降解反應對溫度變化敏感性比較弱。

在相同溫度下,不同的pH對花色苷的降解速率不一樣[25],隨pH的增大,花色苷的降解速率加快。在pH為1時,薰衣草花色苷Z值最小,活化能Ea最大,說明薰衣草花色苷在此時熱穩定性最好,熱降解需要更高的能量。隨著pH的增大,Z值逐漸增大,活化能Ea逐漸減小,同樣說明隨 pH增大,薰衣草花色苷的熱穩定性變差。

表5顯示不同pH下,花色苷溶液的熱降解熱力學參數,可以進一步解釋熱降解反應中發生的各種現象。焓變ΔH客觀反映了化學鍵的強度大小,值越小表示反應的勢壘越低,越容易發生反應。值得注意的是相同pH下,不管溫度如何變化,薰衣草花色苷的焓變ΔH幾乎相等,變化不大,說明花色苷降解所需要的能量勢壘大小與溫度無關。

表5 不同pH下花色苷溶液熱力學參數Table 5 Thermodynamic parameters of anthocyanin solution at different pH values

3 結論

本實驗利用超聲波輔助酶法提取薰衣草中花色苷,在單因素實驗確定最佳加酶量0.10%和pH為3的基礎上,以超聲時間、酶解溫度、酶解時間和乙醇濃度為主要因素進行Box-Behnken實驗設計,建立薰衣草花色苷提取的數學模型。經響應面優化得出提取薰衣草花色苷的最佳工藝參數為:乙醇濃度50%、酶解溫度50 ℃、酶解時間62 min、超聲時間25 min,在此條件下薰衣草花色苷得率為6.22%,較單一超聲提取法(4.88%),超聲輔助酶法具有明顯提取優勢。另外,通過對不同pH和溫度下純薰衣草花色苷穩定性的研究發現,不同pH下,薰衣草花色苷熱降解符合一級動力學方程;薰衣草花色苷熱穩定性較差,當pH6.0時,其對熱最為敏感,pH1.0時,其熱穩定性最強;在相同pH下,花色苷降解所需要的能量勢壘大小與溫度無關。