中空纖維膜三相液相微萃取法測定豬尿及牛奶中的鹽酸克倫特羅

(泰州市食品藥品檢驗所,江蘇泰州 225300)

鹽酸克侖特羅(clenbuterol,CLB)俗名“瘦肉精”,具有腎上腺素受體激動作用[1],2011年起,我國與墨西哥相繼曝光了大范圍“瘦肉精”事件,引起社會各界廣泛關注。整頓辦函[2010]50號文《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用食品添加劑名單(第四批)》中明確規定不得在養殖環節違法添加鹽酸克倫特羅等(即牛羊豬等肉制品中不得檢出瘦肉精)。針對于動物源性樣品基質復雜性以及目標分析物含量較低等特點,樣品前處理技術是決定所建立的檢測方法成功與否的關鍵步驟。

Pedersen-Bjergaad等[2]于1999年將多孔的聚丙烯纖維膜與支撐液膜萃取原理結合,設置了一種簡單、廉價、一次性使用的萃取體系,即中空纖維膜液液液微萃取(HF-LLLME)。HF-LLLME中最常用的聚丙烯纖維膜內徑為600 μm、膜壁厚度為200 μm、壁上微孔孔徑為0.2 μm、機械性能強、不降解、可耐受大多數有機溶劑。當對接受相體積要求較大時,可以將較長的中空纖維膜折成U型,兩端直接與微量注射器連接,該種方式已被用于萃取環境樣品中的有機汞形態[3]和生物樣品中的抗抑郁藥[4-5];桿狀的中空纖維膜一端可以被封口以防止接受相流失,另一端連接微量注射器用于裝載和抽取接受相[6];也可以兩端都封口,萃取完成后,剪開一端抽回接受相[7-9]。此外,為了加快HF-LLLME的傳質速率,超聲輔助[10]等手段亦被用于HF-LLLME中。由于中空纖維膜膜孔可以阻止大分子化合物進入,HF-LLLME具有較強的凈化基質能力,適于復雜基質樣品分析。

關于液相微萃取技術用于瘦肉精分析的文獻近年也有不少報道,丁芳林等[11]在2008年就探討過采用單滴三相液相微萃取(single drop microextraction,SDME)的方式萃取豬尿中的鹽酸克倫特羅,借助高效液相色譜-紫外檢測器進行檢測,該方法檢出限為25 μg/L。LIU Baomi等[12]采用固相萃取和超聲輔助分散相液液微萃取(ultrasonic assistant dispersive liquid-liquid microextraction,UA-DLLME)結合的雙富集方法提取豬組織中的克倫特羅,用高效液相色譜-紫外檢測器進行檢測,高效的富集效率使得該方法檢出限低至0.07 μg/kg。而HF-LLLME相對于上述SDME或是DLLME來說,具有操作容易掌握、更穩定的特點,已被廣泛應用于元素形態分析[13]、環境污染[14]、法檢研究[15]、藥物分析[16]等領域。本文旨在建立一種綠色、經濟、高效的中空纖維膜三相液相微萃取方法用于富集分離,高效液相色譜/紫外檢測定量檢測豬尿及牛奶中痕量鹽酸克倫特羅的方法,期望將液相微萃取技術進一步拓展到復雜基質樣品中痕量甚至超痕量目標分析物的分析檢測中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬尿 取自于本地養豬場(江蘇,泰州);牛奶 購買于本地超市;中空纖維膜 Q 3/2 Accurel聚丙烯中空纖維膜(Membrana,Wuppertal,Germany),其內徑600 μm,膜厚度為200 μm,膜孔徑為0.2 μm。將中空纖維膜剪成 4 cm的小段(其膜腔內大約可容納12.5 μL的接受相),施加壓力將其一端封口,并用丙酮超聲清洗后晾干備用;鹽酸克倫特羅(clenbuterol,CLE) 純度為98.5%,購于德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈(色譜純) 購于國藥集團;甲醇(色譜純) 購于美國MREDA公司;甲酸胺、甲酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸、乙酸鈉、甲苯(均為分析純) 購于國藥集團;β-葡萄糖酶醛甙酶/芳香基硫酸酯酶(β-Glucuronidase/aryl sulfatase;10000 U/mg) 購于sigma-aldrich。

Waters e2695液相色譜-2498型紫外檢測器 美國沃特世公司;C-MAG-HS7磁力加熱攪拌器 德國IKA公司;XS204萬分之一電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)公司;Allegra 64R 冷凍臺式高速離心機 BECKMAN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備方法

1.2.1.1 豬尿 將所取得的尿樣適量分成四等份,分別為不加標、加入低、中、高濃度克倫特羅標準溶液(分別為5、50、500 μg/L),經5000 r/min離心20 min之后取上清液,經過0.22 μm濾膜過濾后,用0.1 mol/L NaOH溶液稀釋2倍,用于后續萃取檢測。

1.2.1.2 牛奶 前處理過程參考文獻[17]和中華人民共和國國家標準GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》。稱取5.00 g牛奶四份,分別為不加標、加入低、中、高濃度克倫特羅標準溶液(分別為5、50、500 μg/kg),于50 mL離心管中,加入100 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液,10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,于37 ℃水浴中酶解12 h。取出,降至室溫,加入10 mL乙腈,渦旋混勻,超聲提取20 min,水平振蕩5 min,10000 r/min離心10 min,取上層乙腈層于另一離心管中,下層水相再加入乙腈重新提取1次,合并兩次乙腈層,加入5 mL正己烷,振蕩5 min,4000 r/min離心10 min,移去正己烷層,向乙腈提取液中加入1.0 g 氯化鈉,靜止分層。將乙腈層溶液轉移至雞心瓶中,旋蒸至干,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液復溶。后經HF-LLLME萃取富集后測定。

1.2.2 中空纖維膜三相液相微萃取方法(HF-LLLME) 本實驗中的HF-LLLME主要基于疏水作用和pH梯度來完成萃取的,陽離子型的目標分析物(如鹽酸克倫特羅)會在強堿性條件下去質子化,以疏水性較強的分子形式存在,因此會被中空纖維膜的膜孔中的有機溶劑所萃取,而膜腔中的酸性接受相則通過使目標分析物質子化而將其反萃至接受相中,其克倫特羅分子結構及其萃取機理由圖1所示。自制的HF-LLLME操作裝置如圖2所示,具體萃取過程為:將7 mL含0.1 mol/L NaOH的樣品(pH約為12.8)放置于含有攪拌磁子的7 mL的樣品瓶中,用25 μL平頭注射器抽取12.5 μL的接受相(0.1 mol/L HCl),將中空纖維膜套在注射器的針尖端,并將其浸泡在甲苯中約3 s,取出待甲苯揮發完后將注射器內的接受相打入中空纖維膜的膜腔中,并將中空纖維膜浸泡在中間相(甲苯)中約25 s后,取出快速置于樣品中開始萃取。萃取完成后移出注射器,抽回接受相用于后續HPLC-UV分析。

圖1 鹽酸克倫特羅分子結構 及HF-LLLME萃取克倫特羅機理Fig.1 Chemical structure of clenbuterol and mechanism of HF-LLLME

圖2 HF-LLLME萃取裝置Fig.2 The home-made hollow fiber based liquid-liquid-liquid microextraction apparatus

1.2.3 高效液相色譜-紫外檢測方法色譜條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫30 ℃;進樣體積10 μL;流動相A為50 mmol/L甲酸銨溶液,用甲酸調節其pH為3.5,流動相B為乙腈,流動相A梯度如下:0～15 min(80%→40%),15～20 min(40%→40%),20～21 min(40%→80%),21～25 min(80%→80%)。

1.3 數據分析

本文原始數據均來自Waters Empower3,采用Origin 8軟件進行數據分析及圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 中空纖維膜三相液相微萃取方法條件優化

在本次HF-LLLME萃取過程中,有機溶劑的選擇,給予相與接受相的酸堿介質及pH的改變以及采用動態萃取模式都會影響分配系數,從而改變富集倍數。另一方面,加大接觸面積、攪拌也可以增加傳質速度盡快達到萃取平衡。

綜上所述,本實驗直接選定0.1 mol/L的NaOH和HCl這兩種強堿強酸作為本實驗的給予相和接受相介質(后續不再對其進行優化)[16],對影響萃取效率的其他主要因素,包括中間相有機溶劑種類、萃取時間、攪拌速率以及鹽濃度等進行了優化。

2.1.1 有機溶劑的選擇 在HF-LLLME中,有機溶劑的選擇是至關重要的,有機溶劑必須滿足以下特點:與水不互溶,對所選目標分析物具有較好的萃取效率以及萃取重現性,同時應盡可能具有較小的傳質阻力。考慮到鹽酸克倫特羅分子結構中含有苯環且具有一定極性。因此有機溶劑考察了苯系物中的甲苯、苯乙醚及極性略大的正辛醇三種不同種類有機溶劑對萃取效率的影響,結果如圖3所示,甲苯對其萃取效率最高,因此最終采用甲苯作為萃取中間相。

圖3 有機溶劑種類對萃取效率的影響Fig.3 Influence of various organic solvents on HF-LLLME

2.1.2 萃取時間的選擇 HF-LLLME是平衡萃取,萃取時間是影響萃取效率至關重要的又一因素。本實驗考察了萃取時間在10～40 min之間對萃取效率的影響,結果如圖4所示,10～20 min萃取效率顯著升高,在20～30 min萃取基本達到平衡,30～40 min略有下降,推測其原因可能是聚丙烯纖維膜膜孔中的有機溶劑隨著萃取時間延長發生不可逆擴散損失而導致,綜上考慮,最終選擇30 min作為萃取時間。

圖4 萃取時間對萃取效率的影響Fig.4 Influence of extraction time on HF-LLLME

2.1.3 攪拌速率的選擇 理論上,增加攪拌速率可以增大傳質速率從而提高萃取效率,但是更高的攪拌速率可能會使樣品溶液形成極其不穩定的湍流,從而使萃取過程不穩定,結果不重現,因此本文僅考察了攪拌速度在1000～5000 r/min之間對萃取效率的影響,結果如圖5所示,在1000～3500 r/min之間,萃取效率隨著攪拌速率增加而顯著提高,在3500～5000 r/min基本達到平衡,為了兼顧萃取效率和萃取重現性,最終選擇攪拌速度為4000 r/min。

圖5 攪拌速率對萃取效率的影響Fig.5 Influence of stirring rate on HF-LLLME

2.1.4 鹽效應考察 由于最終樣品為尿樣和牛奶,基質中鹽成分較高,因此,本實驗對鹽濃度(1%～20% NaCl)也進行了考察,結果(見圖 6)表明,在所考察范圍內,鹽濃度對CLB的萃取無明顯影響,因此選擇在給予相中不加鹽。

圖6 鹽濃度對萃取效率的影響Fig.6 Influence of NaCl concentration of on HF-LLLME

2.2 方法分析性能考察

在中空纖維膜三相液相微萃取最佳條件下,即將不同濃度的克倫特羅溶解于0.1 mol/L NaOH溶液中作為萃取的給予相,甲苯為中間有機相,12.5 μL 0.1 mol/L HCl溶液作為接受相,在4000 r/min的攪拌速度下萃取30 min,將10 μL最終萃取所得溶液進入高效液相色譜進行檢測,考察了該萃取方法與高效液相色譜-紫外檢測器聯用下(HF-LLLME-HPLC-UV)方法的檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)、線性范圍、萃取相對標準偏差等分析性能參數,結果見表1。該方法在1.5～1000 μg/L范圍內具有良好線性,線性方程為Y=3011.8X-7116.4(r=0.9980),方法的檢出限、定量限分別為0.5和1.5 μg/L,可以看出,未經過HF-LLLME,直接進液相檢測的檢出限為100 μg/L,而經過HF-LLLME萃取富集后,檢出限低至0.5 μg/L,使得HPLC/UV測定鹽酸特羅的靈敏度提高了約2個數量級。

表1 HF-LLLME-HPLC-UV方法分析性能參數Table 1 Analytical performance of the HF-LLLME-HPLC-UV method

注:a:10 μL標準溶液進樣方法(standard injection,SI)檢出限(相當于HPLC-UV自身對克倫特羅的響應度);b:通過HF-LLLME萃取富集的方法(HF-LLLME-HPLC-UV)檢出限。

表2 HF-LLLME-HPLC-UV方法回收率Table 2 Analysis of CLB in swine urine and cow milk samples by the HF-LLLME-HPLC-UV method

注:ND:未檢出。

2.3 方法準確度及精密度

對牛奶、豬尿等樣品進行了加標回收實驗,在5、50、500 μg/L或μg/kg的添加水平下,采用外標法進行定量(標準曲線是一系列濃度標準物質配制在蒸餾水中進行HF-LLLME萃取后經HPLC/UV測定獲得的),加標回收結果具體如表2所示,克倫特羅在牛奶中的加標回收率為80.2%～94.4%,相對標準偏差在2.7%～6.4%之間,在豬尿中的加標回收率為87.0%～102.4%,相對標準偏差在5.1%～9.8%之間。

圖7、圖8分別是豬尿和牛奶的實際樣品分析色譜圖與標準品分析圖的對比,由色譜圖可以明顯看到兩種現象:a.50 μg/L加標的豬尿及50 μg/kg牛奶樣品不經過HF-LLLME,無法檢測到CLB的峰(分別見圖7(b)和圖8(b));經過HF-LLLME富集后CLB峰型明顯(分別見圖7(c)和圖8(c)),且峰高及峰面積都與10000 μg/L標準品色譜圖峰(分別見圖7(a)和圖8(a))接近,說明本文中HF-LLLME顯示出超高富集濃縮效率;b.經HF-LLLME富集后的豬尿樣品色譜圖雜峰明顯少于未經HF-LLLME富集的(比較圖7(c)和圖7(b)),說明HF-LLLME凈化基質能力顯著,牛奶樣品不明顯估計是因為牛奶在預處理時已經將基質足夠凈化。

圖7 標準品與豬尿樣品分析色譜圖比較Fig.7 The chromatograms of standard CLB solution and swine urine sample spiked with CLB

圖8 標準品與牛奶樣品分析色譜圖比較Fig.8 The chromatograms of standard CLB solution and milk sample spiked with CLB

3 結論

本實驗采用中空纖維膜三相液相微萃取與高效液相色譜-紫外檢測法相結合,建立了一種高效、快速、經濟、可靠的富集分離方法,可用于定性、定量分析豬尿及牛奶中的痕量鹽酸克倫特羅。其中,HF-LLLME的應用極大的避免了生物樣品中的基質干擾,同時起到高倍富集樣品基質中的特定目標分析物(CLB)的效果,將HPLC-UV測定鹽酸克倫特羅的檢測靈敏度提高了約兩個數量級,拓展了HPLC-UV在痕量甚至超痕量分析領域中的應用范圍。