基于近紅外光譜對嬰幼兒配方奶粉中非法添加物的快速鑒別方法

陳秀明,3,劉 青,*,梁浩新,張嘉俊,文慧依,謝錦鋒,陳少敏

(1.廣東檢驗檢疫技術中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623;3.北京師范大學-香港浸會大學聯合國際學院, 珠海市農產品質量與食品安全重點實驗室,廣東珠海 519087)

嬰幼兒配方奶粉是根據不同生長時期嬰幼兒的營養需要進行設計的,以脫脂奶粉、乳清粉、乳糖等為主要原料,加入適量的維生素和礦物質以及其他營養物質,經加工后制成的粉狀食品。近10年來嬰幼兒配方奶粉的市場需求也在不斷增大,2007年至2010年間,嬰幼兒配方奶粉的世界產量平均每年以8.2%的速度增長,2010～2014年平均同比增長達到11%,2018年進口嬰幼兒配方奶粉進口量為32萬噸,同比增加9.6%。

巨大的市場需求為不法商人帶來了牟取暴利的可乘之機,市場上摻假,以次充好的事件屢見不鮮。而不法分子向乳制品中添加三聚氰胺是為了提高氮含量,那么他們為了規避監管部門的監查,是否添加其他類似的富含氮的非法添加物,如雙氰胺、環丙氨嗪等等,這也是我們值得考慮和預防的問題。對于經濟利益驅使的摻假行為來說,在ppm量級水平摻假基本上是無利可圖的,因此,實際的摻假樣品中摻假物質的含量應該更高,且應對經濟利益驅使的摻假行為時,不需要進行分離,而是檢測樣品整體成分的“指紋圖譜”,這種技術具有非常重要的作用。

近紅外光譜技術是一種便捷、無損、成本低,近幾年來廣泛應用于石油、化學、制藥、農業、食品等行業的高效檢測工具,在摻假鑒定方面也得到廣泛運用和推廣[1-4]。本文運用近紅外光譜技術結合化學計量學方法Adulterant Screen算法,建立嬰幼兒配方奶粉中常見非法添加物的快速鑒別方法,此方法建立的模型能實現快速鑒別多個非法添加物,如:雙氰胺、雙縮脲、尿素、三聚氰胺、硫脲、環丙氨嗪等6種含氮非法添加物,為嬰幼兒配方奶粉的檢測和監管提供強有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒配方奶粉 從廣州式各大超級市場購買,收集16個品牌嬰幼兒配方奶粉共100個試樣,其中嬰兒配方奶粉35個、較大嬰兒配方奶粉36,幼兒配方奶粉29個;雙氰胺、雙縮脲、尿素、三聚氰胺、硫脲、環丙氨嗪 分析純AR,含量≥99%,國藥集團化學試劑有限公司。

DairyGuard近紅外光譜奶粉分析儀 PE(Perkin Elmer)公司,光源為NIR,分光器為CaF2,檢測器為NIR TGS,積分球為InGaAs,自動切換。光譜范圍10000～4000 cm-1,分辨率16 cm-1,波數準確率±0.03 cm-1。

1.2 實驗方法

1.2.1 摻假物的選擇 在乳制品中添加三聚氰胺旨在提高氮含量,替代乳制品中的蛋白質,添加其他類似的含氮非法添加物也可以達到同樣的效果,故此,本文選擇可能出現的同類別含氮的非法添加物6種:雙氰胺、雙縮脲、尿素、三聚氰胺、硫脲、環丙氨嗪。

1.2.2 樣品集的劃分 收集的100個嬰幼兒配方奶粉樣品中,其中33個用作建立校正模型的集樣品,33個作為驗證集樣品,16個作為模擬摻假及摻雜樣品,6個作為空白待測樣品,12用作未知樣品。

1.2.3 模擬摻假樣品的制備 將16個嬰幼兒配方奶粉作為模擬摻假樣品,其中6個用在單組分摻假樣品,摻假添加4個水平濃度(0.04%～1.0%),6個用在二組分摻假樣品,采用6個摻假物隨機組合添加共6個組合,選擇添加濃度為單組分實驗的檢出限2倍、5倍、10倍3個水平濃度;4個用作三組分模擬摻假樣品,采用摻假物隨機組合共4個組合:三聚氰胺+雙氰胺+雙縮脲、雙縮脲+環丙氨嗪+雙氰胺、尿素+三聚氰胺+硫脲、尿素+硫脲+環丙氨嗪,選擇添加濃度為單組分實驗結果的檢出限2倍、5倍。

模擬摻假樣品的制備:首先將6種經研磨至均勻粉末狀的含氮非法添加物稱取至干凈玻璃瓶中,再補充嬰幼兒配方奶粉至50 g,密封充分混勻,作為模擬摻假樣品,每個模擬摻假添加濃度制備6個平行樣。

1.2.4 光譜采集

1.2.4.1 樣品及摻假物的光譜采集 環境溫度20 ℃,相對濕度 45%,掃描范圍10000～4000 cm-1,掃描次數 32,每次扣除空氣本底,實時扣除空氣中的水和二氧化碳的強吸。摻假物先用研缽磨制成均勻的粉末,再進行光譜采集。為了減小樣品及摻假物顆粒不均勻產生的誤差,測量2次平行,取2次采樣的平均值,裝樣時,在裝好樣品后用實心圓形鐵塊輕輕壓實,使得粉末分布均勻[5]。

1.2.4.2 光譜預處理 為了消除樣品光譜信號的高頻噪聲、基線漂移、雜散光、樣品背景等非目標因素,通常采用光譜預測理的方法來減弱或消除非目標因素對光譜的影響[6-9]。常用的光譜預處理方法有正規化、平滑(SG)、歸一化、一階導數(D1)、二階導數(D2)、多元散射校正(MSC)、標準正態變量變換(SNV)等[10-15]。本文通過儀器內置Spectrum FTIR軟件進行光譜采集,選取的波段范圍為10000～4000 cm-1,采用對樣品光譜進行一階求導、平滑(平滑窗口寬度為9)等預處理方法來濾除各類因素產生的高頻噪音。

1.2.5 Adulterant Screen法建立鑒別模型

1.2.5.1 Adulterant Screen算法 Adulterant Screen算法:是專門為復雜基質中任意潛在摻假成分篩查而設計的新算法,該法既保留SIMCA等非靶向化學計量學方法的優勢,而且通過建立的潛在摻假成分光譜數據庫進行計算獲得更高的鑒假靈敏度。當獲得一個未知樣品光譜后,Adulterant Screen算法首先將其與標準樣品(材料光譜)的主成分(PCA)模型進行比較,其次使用各種潛在摻假成分的光譜對該模型進行擴展,如果在模型中增加某種摻假成分光譜后,未知樣品光譜與其擬合程度得到顯著增加,說明該樣品很可能含有這種摻假成分。該算法輸出結果是摻假成分的估算濃度、檢測限及置信度指標,對濃度的估算是根據數據庫中摻假成分光譜與其在樣品光譜中的分量的相對強度,沒考慮有效光程的差異,因此為半定量估算結果,檢測限也采用同樣方式,置信度指標:可能、有可能、非常可能,顯示的是該摻假成分實際存在的可能性大小,摻假物能準確識別且可信度為“可能”時,可定義為最低檢出限[3,16-18]。

表1 空白樣品及單組分摻假樣品的鑒別結果(n=6)Table 1 Identification results of blank samples and single component adulterated samples(n=6)

1.2.4.2 非法添加物鑒別模型的建立 a材料光譜模型建立:將收集到的66個嬰幼兒配方奶粉樣品采集的光譜圖添加到“嬰幼兒配方奶粉分類模型”中,建立校正和驗證用光譜數據庫。b摻假物光譜模型建立:將收集到的6種含氮摻假物得到的光譜圖添加到“摻假物模型”中,用作摻假物光譜數據庫。將上述“嬰幼兒配方奶粉分類模型”和“摻假物模型”兩組光譜庫導入Spectrum FTIR軟件中,運用Adulterant Screen算法進行計算,即完成非法添加物鑒別模型的建立。

1.3 數據處理

采用SpectrumFTIR軟件進行采集并處理計算[19]。

2 結果與分析

2.1 單組分摻假樣品的鑒別結果與分析

樣品經DairyGuard近紅外光譜奶粉分析儀采集光譜(所采集的樣品近紅外光譜如圖1,采集的非法添加物近紅外光譜如圖2所示),a基于Adulterant Screen算法建立的“嬰幼兒配方奶粉分類模型”,將樣品光譜與“嬰幼兒配方奶粉分類模型”的PCA光譜模型進行比較,驗證是否為嬰幼兒配方奶粉;b基于“摻假物模型”,將樣品中可能潛在的摻假成分光譜對PCA光譜模型進行擴展,如果模型增加某種潛在成分光譜,待測樣品光譜與其擬合程度得到顯著增加,說明該樣品很可能含某種摻假成分。此時Adulterant Screen算法將提取出來摻假成分光譜,且與“摻假物模型”的光譜擬合程度明顯增加,說明該嬰幼兒配方奶粉樣品存在摻假物成分,并同時給出置信度指標。

圖1 66個嬰幼兒配方奶粉樣品疊加近紅外光譜圖Fig.1 Superimposed near-infrared spectrogram of 66 infant formula samples

圖2 6種非法添加物疊加近紅外光譜圖Fig.2 Near infrared spectra of 6 kinds of illegal additives

空白樣品及單組分摻假樣品的鑒別結果如表1,從表1可以看出,所有待測樣品經Adulterant Screen法計算處理后,均識別判斷為嬰幼兒配方奶粉樣品,因此軟件的第一步驗證全部是通過的,第二步驗證時,只有空白待測樣品驗證結果為通過,并能與嬰幼兒配方奶粉材料光譜匹配正常,其它均為驗證失敗,與嬰幼兒配方奶粉材料光譜匹配不正常,每種模擬摻假樣品的6平行樣品均能準確的識別出各類摻假物且置信度都為“可能”,可以定義為本方法的檢出限,識別率為100%。同時,表1所示的結果識別濃度與模擬添加的濃度有所差異,這是因為建立摻假模型時,對摻假物濃度的估算是根據數據庫中摻假成分光譜與其在樣品光譜中的分量的相對強度,沒考慮有效光程的差異,因此為半定量估算結果,數據僅做參考。單組分摻假樣品的模擬摻假添加4個水平濃度(0.04%～1.0%),每種模擬摻假樣品的6平行樣品均能準確的識別出各類摻假物且置信度都為“可能”以上,識別率為100%。

以摻假0.5%硫脲樣品為例的驗證結果:第一步驗證通過,說明該樣品為嬰幼兒配方奶粉,將摻假樣品光譜與標準樣品(材料光譜)的主成分(PCA)模型進行比較,產生“擬合的摻假光譜圖”(圖3所示);第二步驗證失敗,因為樣品光譜與標準樣品(材料光譜)擬合產生較大的殘差,再將殘差光譜對該模型進行擴展,如果在模型中增加樣品殘差光譜后,樣品的殘差光譜與摻假物硫脲擬合程度得到顯著增加,說明該樣品很可能含有摻假成分,如圖4及圖5所示,此時軟件能快速準確識別摻假物為硫脲,并給出置信度指標為“很可能”,實現了摻假物有效的鑒別。

圖3 摻假0.5%硫脲樣品的擬合光譜圖Fig.3 Fitting spectrogram of adulterated 0.5% thiourea sample

圖4 摻假0.5%硫脲樣品的殘留光譜圖Fig.4 Residual spectrogram of 0.5% thiourea adulterated samples

圖5 摻假0.5%硫脲樣品的光譜圖Fig.5 Spectrogram of adulterated 0.5% thiourea sample

無摻假樣品的驗證結果:第一步驗證通過,表示該物質為嬰幼兒配方奶粉樣品,將摻假樣品光譜與標準樣品(材料光譜)的主成分(PCA)模型進行比較,產生“擬合的摻假光譜圖”(圖6所示);第二部驗證通過,即樣品光譜與標準樣品(材料光譜)擬合產生極小的殘差,沒有明顯跡象表明該樣品中含有未被擬合的異常成分,如圖7,表明該物質沒有任何摻假成分。

圖6 無摻假樣品的擬合光譜圖Fig.6 Fitting spectra of unadulterated samples

圖7 無摻假樣品的殘留光譜圖Fig.7 Residual spectrogram of unadulterated samples

2.2 二組分摻假樣品的鑒別結果與分析

二組分摻假嬰幼兒配方奶粉樣品的6個組合,3個摻假添加水平濃度的樣品,每個組合的每個添加水平均做6次平行測試,故模擬摻假樣品共18組108個樣品。鑒別方法與單組分摻假樣品同理。二組分摻假樣品的鑒別結果如表2。

在18組108個樣品識別數據中,3個組合的3個摻假添加水平濃度9組54個數據識別完全正確,3個組合其中2個高濃度摻假添加水平36個數據識別完全正確,占總數比例為83.3%;有 3 組合最低濃度摻假添加水平18數據只能識別出其中一個組分,占比總數的 16.7%;從二組分的識別結果可知,Adulterant Screen 算法對二組分摻雜識別效果比單組分的差,且低濃度的識別能力弱。

2.3 三組分摻假樣品的鑒別結果與分析

三組分摻假嬰幼兒配方奶粉樣品共4種摻假組合:三聚氰胺+雙氰胺+雙縮脲、雙縮脲+環丙氨嗪+雙氰胺、尿素+三聚氰胺+硫脲、尿素+硫脲+環丙氨嗪,摻假添加濃度水平2個:0.2%、0.5%,每個濃度水平做6次平行測試,共8組48個模擬摻假樣品。識別結果見表3。在 8 組三組分48個識別數據中,4 組24個數據識別完全正確,占總數比例為50%,其中包括添加濃度0.2%、0.5%各兩組;有4組24數據能正確識別出其中兩個組分,其中包括0.2%添加濃度的2組、0.5%添加濃度的2組,占比總數的50%;一組分識別正確和三個組分均未能識別的個數為零。從三組分的識別結果可知,摻假物濃度越高,識別率也會越高,這說明Adulterant Screen算法對三組分低濃度的摻雜識別效果有所欠缺。

表2 二組分摻假樣品的鑒別結果(n=6)Table 2 Identification results of two-component adulterated samples(n=6)

表3 組分摻假樣品的鑒別結果Table 3 Identification results of three-component adulterated samples

2.4 無摻假樣品的鑒別結果分析

12個無摻假嬰幼兒配方奶粉中,正確識別出無摻假物的有9個,識別率為75%;識別出為其他摻假物,置信度為“不太可能”的有3個,占比25%,由識別給出置信度可知,3個均為檢出限以下,因此,可以判定無摻假嬰幼兒配方奶粉在檢出限以上的準確識別率為100%。

3 結論

以16個品牌100個嬰幼兒配方奶粉樣品及6種非法添加物為對象,基于近紅外光譜技術及Adulterant Screen算法建立了嬰幼兒配方奶粉中非法添加物的快速鑒別方法,其中Adulterant Screen算法不僅保留了SIMCA等非靶向化學計量學方法的優勢,不需要耗時建立偏最小二乘(PLS)或其他化學計量學校正模型,通過簡單的調整即可,而且通過潛在摻假成分光譜數據庫獲得了更高的靈敏度[20]。實驗結果表明,對于單組份摻雜嬰幼兒配方奶粉的識別最低檢出濃度為三聚氰胺0.04%、環丙氨嗪為0.05%,尿素、雙縮脲及硫脲為0.1%,雙氰胺為0.2%。對于二組分和三組分摻假奶粉在兩倍到十倍檢出限濃度的準確識別率分別達到了83.3%和50%,摻假物濃度越高,識別率也會越高,對無摻假未知樣品的識別率100%。同時,該鑒別模型可以通過一個模型即可實現快速鑒別多個非法添加物。另外,收集的6種含氮的非法添加物具有較相似的氨基(-NH2)及氰胺等化學基團,因此具有較相似的近紅外光譜圖,如果多種非法添加物在待測樣品中混合存在時,大大的增加了識別難度,甚至無法正確識別出摻假物,故此模型對二組分和三組分摻假奶粉的摻假識別率較差。

利用近紅外光譜技術結合Adulterant Screen算法建立的嬰幼兒配方奶粉中非法添加物的快速鑒別方法,為嬰幼兒配方奶粉摻假鑒別提供了一種操作簡單、快速、可靠、便捷且樣品無損的鑒別方法,能有效的運用于嬰幼兒配方奶粉摻假鑒別的日常檢測工作,為嬰幼兒配方奶粉的檢測和監管提供強有力的技術支持。