對一測多評法測定蜂膠類保健食品中芹菜素等5種成分含量的評價研究

楊 玲,劉成浩,韓蕭茜,劉 齊,馮曼琳,杜 勇

(北京市藥品檢驗所,北京 102206)

蜂膠為蜜蜂科昆蟲意大利蜂(ApismelliferaL)工蜂采集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物。性苦,辛,寒。歸脾,胃經。用于體虛早衰,高脂血癥等[1]。由于蜂膠具有多種藥理作用,故在保健食品中得到了較為廣泛的應用。根據國家食品藥品監督管理局網站上的數據查詢結果,截止到2018年9月30日,國產和進口保健食品中以蜂膠為原料的共有1459種,主要功效為提高免疫力、抗疲勞、調節血脂等。

黃酮類化合物是蜂膠中的主要活性成分[2-6],其中高良姜素是天然的黃酮醇,具有抗炎、抗過敏、抗菌、抗氧化、抗肥胖、抗缺氧、清除自由基及抗癌等多種藥理作用[7-9];松屬素(又名喬松素)能夠保護血管內皮細胞[10],具有抗菌、抗誘變、抗氧化、殺蟲、抗腫瘤、局麻等多種藥理活性[11-12];白楊素(又名柯因)對多種腫瘤細胞具有良好的抗增殖活性,對某些結腸癌、肝癌、胃癌、白血病、黑色素瘤細胞系具有促凋亡作用[13];山奈酚可抗癌、抗炎、保護肝臟及心肌、防治動脈粥樣硬化、骨質疏松及糖尿病[14];芹菜素具有抗炎、抗痛風、抗氧化、免疫調節等功能[15]。上述化合物的藥理作用與其保健功效相關,可作為質控指標。除此之外,還有楊梅苷、蘆丁、槲皮素等其他黃酮。但是很多研究顯示中國蜂膠中可能不含有楊梅苷、蘆丁[16-20],或是含量極少。蜂膠中極性相似的成分很多,保留時間接近,很容易造成人為混淆。例如蘆丁與3,4-二甲氧基肉桂酸,槲皮素與短葉松素,液相保留時間相近,紫外光譜相似[2]。符軍放[18]在對9個主產區的30批蜂膠樣品成分分析中發現,槲皮素含量甚微,楊梅苷和蘆丁均未檢測到。本實驗測定的12批樣品中,均未檢出楊梅苷,有3批未檢出蘆丁,槲皮素含量也較低。故選擇芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素作為產品的質量控制指標加以測定。

國標GB/T 19427-2003中采用液相色譜和液質聯用方法測定楊梅苷等8種黃酮[21],中國藥典2015年版采用高效液相色譜法(HPLC)測定蜂膠中白楊素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和喬松素[1]。李熠等[22],于世鋒等[23],吳毅等[24]采用超高效液相色譜法(UPLC)及HPLC同時測定蜂膠中的多種黃酮及酚酸的含量。但目前絕大多數蜂膠類保健食品都采用測定總黃酮的含量以控制產品質量,此類方法專屬性差,精確度低,難以準確評估產品質量,同時也增加了造假及使用替代原料的風險。蜂膠中化學成分及有效成分的多樣性、復雜性,使得測定單一的功效或指標性成分難以準確表達產品質量,只有對其中的多種有效成分或主要成分進行綜合性評價,才能達到全面控制質量的目的。多指標質控高昂的檢測成本反過來又限制了此種質量控制模式在實際生產、科研、監督中的應用。面對這種情況,急需建立一種科學、高效的質量控制方法。一測多評法整合了內標、校正因子、紫外百分吸收系數等方法的優勢,借助待測物中有效成分內在的函數和比例關系,以一個對照品為參照物,建立該成分與其他成分間的相對校正因子,并通過其計算含量,實現多組分的同時測定。該方法已經在中藥材[25-30]、中成藥[31-35]及食品[36]的質量評價當中得到了應用。

本研究參考文獻[37-39]的技術要求,建立一種簡便高效的蜂膠類保健食品中多個黃酮組分的含量測定方法。以芹菜素為參照物,采用“一測多評法”測定芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素的含量,并采用回歸方程法同步測定并加以驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芹菜素(批號:111901-201603,純度99.2%)、山奈酚(批號:110861-201611,純度95.5%)、白楊素(111701-200501,純度100%)及高良姜素(批號:111699-201703,純度99.6%) 中國食品藥品檢定研究院;松屬素(MKCF0471,純度99%) Sigma公司;甲醇 色譜純,默克股份兩合公司;磷酸 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;水 重蒸餾水;測定用樣品為蜂膠液和蜂膠軟膠囊 分別由不同廠家生產。

Waters e2695高效液相色譜儀(方法學考察所用) 沃特世公司;島津LC-20AD高效液相色譜儀 日本島津制作所;Aglient-1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;XS-205型電子分析天平 梅特勒-托利多集團;SB-25-12D型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準品溶液制備 精密稱取芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素標準品適量,加甲醇制成質量濃度分別為41.74、99.70、185.2、205.2、220.0 μg/mL的混合標準品溶液。

1.2.2 供試品提取條件的優化 參考文獻[1-2,7-9]提取方法,取編號為001的蜂膠液樣品適量,混勻,精密稱取0.5 g各2份,分別以甲醇、乙醇為提取溶劑,室溫超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,進樣后記錄峰面積,以峰面積積分值為縱坐標,待測組分為橫坐標,制作柱形圖后比較最優提取結果,確定提取溶劑后同法操作,精密稱取0.5 g各2份,考察15、30、45 min 3種提取時間,進樣后記錄峰面積,以峰面積積分值為縱坐標,待測組分為橫坐標,制作柱形圖后比較最優提取結果,確定最佳提取時間。

1.2.3 供試品溶液制備 取蜂膠液適量混勻,或蜂膠軟膠囊內容物適量混勻,精密稱取0.5 g(蜂膠液),0.25 g(蜂膠軟膠囊內容物)置于25 mL容量瓶中,加甲醇20 mL溶解,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,冷卻后用甲醇定容至刻度,搖勻。以0.45 μm微孔濾膜濾過,取濾液,待測。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Aglient ZORBAX SB-C18,柱長250 mm,內徑4.6 mm,粒徑5 μm;流動相甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(洗脫程序見表1);檢測波長為270 nm;柱溫為30 ℃;流速為:1.0 mL/min,進樣量10 μL[21]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系考察 分別精密吸取系列質量濃度的混合標準品溶液各10 μL進樣,記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(Y),標準品濃度為橫坐標(X)進行線性回歸,計算回歸方程。

1.2.5.2 相對校正因子的計算 本研究采用以多個標準品質量濃度點計算所得的fsi取平均值作為定量用fsi。計算公式為:fsi=(As×Ci)/(Ai×Cs),式中:fsi為相對校正因子,As為參照物標準品s峰面積,Cs為參照物標準品s濃度,Ai為待測成分標準品i峰面積,Ci為待測成分標準品i濃度。

1.2.5.3 相對保留時間的確定 取混合標準品溶液進樣,記錄5組分的保留時間,并分別計算山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素的相對保留時間。

1.2.5.4 精密度試驗 取同一混合標準品溶液,連續進樣5次,記錄各組分色譜峰峰面積,并計算RSD值。

1.2.5.5 穩定性試驗 取編號為001的蜂膠液樣品,按1.2.3項下方法制備供試品溶液,分別于制備后0、4、8、12、24 h注入液相色譜儀,記錄各組分峰面積,并計算RSD值。

1.2.5.6 重復性試驗 取編號為001的蜂膠液樣品,按照1.2.3項下方法制備6份供試品溶液,進行測定,計算芹菜素等5組分的含量,并計算RSD值。

1.2.5.7 回收率試驗 取編號為001的樣品,精密稱定9份,每份0.25 g,分成3組,每組3份,分別精確添加含芹菜素0.5218 mg/mL的標準品溶液0.10、0.15、0.20 mL,含山奈酚0.9970 mg/mL的標準品溶液0.10、0.15、0.20 mL,含白楊素1.024 mg/mL的標準品溶液0.50、0.75、1.0 mL,含松屬素1.041 mg/mL的標準品溶液0.50、0.75、1.0 mL,含高良姜素0.9621 mg/mL的標準品溶液0.50、0.75、1.0 mL,按照“1.2.3”制備供試品溶液,并測定,分別計算回收率:

回收率(%)=(測得量-樣品含量)/加入量×100

1.2.5.8 系統耐用性考察 精密吸取混合標準品溶液,進樣分析,計算以芹菜素為參照物的其余4種成分的相對校正因子及相對保留時間,分別采用3臺不同品牌的高效液相色譜儀,3根不同型號的色譜柱,及在同一臺高效液相色譜儀上選擇3種不同的柱溫和3種不同的流速進行測定。

1.2.6 一測多評法與標準曲線法的測定結果比較 取以蜂膠為單一原料的保健食品12批,其中001、002為蜂膠液,其余為蜂膠軟膠囊,按照1.2.3項下方法制備供試品溶液,測定,并采用標準曲線法和一測多評法分別計算芹菜素等5組分的含量。

1.3 數據處理

利用Excel軟件進行數據統計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 標準品、樣品及空白色譜圖

標準品圖譜中,芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的濃度分別為5.218、12.46、23.15、25.65、27.50 μg/mL;供試品由001號蜂膠液制備,為陽性樣品;空白為樣品空白。由圖1可見,樣品中各個組分分離情況良好,空白無干擾。

圖1 標準品色譜圖(A),供試品色譜圖(B),空白色譜圖(C)Fig.1 HPLC chromatogram of control(A),sample(B),blank(C)注:圖A中,1.芹菜素;2.山奈酚;3.白楊素;4.松屬素;5.高良姜素。

2.2 提取方法的優化結果

參考中國藥典等相關文獻,選擇甲醇和乙醇作為提取溶劑進行考察。從圖2可見,以甲醇為提取溶劑時,白楊素和高良姜素峰面積積分值稍高,其余三組分無明顯差別,故選擇甲醇為提取溶劑。從圖3可見,芹菜素、山奈酚、白楊素的峰面積積分值在超聲處理30 min時為最大,松屬素及高良姜素的峰面積積分值在不同處理時間時基本一致,故選擇提取時間為30 min。

表2 芹菜素等5種組分標準曲線Table 2 Calibration cruve and linear range

表3 山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素相對校正因子Table 3 Relative correcting factors of kaempferol,chrysin,pinocembrin and galangin

圖2 提取溶劑考察結果Fig.2 The comparison of extraction solvent

圖3 提取時間考察結果Fig.3 The comparison of extraction time

2.3 方法學考察結果

2.3.1 線性關系 按1.2.5.1項下進行試驗,結果表明芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素在1.044～20.87、2.492～49.85、4.630～92.60、5.130～102.6、5.500～110.0 μg/mL范圍內線性關系良好,相關系數均為0.9999,結果見表2。

2.3.2 相對校正因子的計算 本研究以芹菜素為參照物,根據不同進樣量分別計算山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的相對校正因子,并求平均值作為最終結果,山奈酚等4組分的相對校正因子分別為1.1929、0.5938、2.7847、0.9727,見表3。

2.3.3 相對保留時間的確定 色譜峰的準確定位是保證QAMS法應用的前提,本研究以芹菜素為參照物,分別計算山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的相對保留時間(計算公式:ras=tRa/tRstRa為待測成分的保留時間,tRs為內參物的保留時間,ras為二者的比值即相對保留時間),以確定其位置。5組分的相對保留時間分別為1.000、1.124、3.582、4.106、4.388,可作為各個組分的定性依據,見表4。在本研究中,每針的分析時間長達85 min,而松屬素和高良姜素的保留時間分別為64和68 min,相對保留時間較為接近,如調整梯度,每針的分析時間將繼續加長。故在今后的含量測定中,可用增加一個對照品的方式來輔助確定二者的準確位置。

表4 5種成分相對保留時間Table 4 Relative retention time of 5 kinds of components

2.3.4 精密度試驗 按1.2.5.4項下進行試驗,芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素峰面積的RSD分別為0.3%、0.1%、0.2%、0.2%、0.2%,表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 按1.2.5.5項下進行試驗,取混合對照品溶液,分別于配制后0、2、4、8、12、24 h進樣分析,記錄各組分峰面積,結果芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素峰面積的RSD分別為1.1%、0.7%、1.2%、1.0%、0.7%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.6 重復性試驗 按1.2.5.6項下進行試驗,芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的含量測定結果見表5,RSD分別為0.9%、1.0%、0.9%、1.1%、0.7%,表明該方法重復性良好。

表5 樣品測定結果重復性考察Table 5 Reproducibility test results

表6 加樣回收率測定結果Table 6 Results of recovery test

續表

表7 不同色譜柱測得相對校正因子Table 7 Relative correcting factors determined by different columns

表8 不同儀器測得相對校正因子Table 8 Relative correcting factors determined by different instruments

表9 不同流速測得相對校正因子Table 9 Relative correcting factors determined by different velocity

表11 不同色譜柱的相對保留時間Table 11 Relative retention times determined by different columns

2.3.7 回收率試驗 按1.2.5.7項下進行試驗,結果見表6,芹菜素等5組分的加標回收率在96.54%～102.06%之間,表明各個組分回收率良好。

2.3.8 系統耐用性考察 按1.2.5.8項下進行試驗,更換儀器和色譜柱后,相對校正因子的重現性良好,RSD為1.3%～3.1%,表明此方法可適用于不同的色譜系統及不同的色譜柱。另外,在同一色譜系統中采用不同的流速和柱溫進行試驗,相對校正因子的重現性良好,RSD為0.3%～1.0%,表明此方法可適用于不同的試驗環境。另外在更換不同的色譜柱后,考察山奈酚等4組分的相對保留時間,RSD為1.6%～2.1%,表明使用不同的色譜柱,相對保留時間變化幅度較小,可準確定位,相關試驗結果見表7～表11。

表10 不同柱溫測得相對校正因子Table 10 Relative correcting factors determined by different column temperature

2.4 一測多評法與標準曲線法的測定結果比較

采用標準曲線法(SCM)和一測多評法(QAMS)分別計算12批樣品(其中001、002為蜂膠液,其余為蜂膠軟膠囊)中山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的含量,結果見表12。兩種方法測定結果相對平均偏差(RAD)在0.5%～2.1%之間,測定結果基本一致。

表12 樣品測定結果Table 12 Results of sample determination

3 結論

本研究采用一測多評法測定以蜂膠為單一原料的保健食品中芹菜素等5種組分的含量,并同時采用標準曲線法加以驗證,通過12批樣品的測定,兩種方法得到的含量值相對平均偏差為0.5%～2.1%,結果基本一致,證明本方法準確可靠,可以在對蜂膠中5種組分的含量進行測定的同時,節約對照品的使用,提高檢驗效率。