南極磷蝦酶解工藝優化及酶解產物對牡蠣肉的冷凍保護作用

,2,3,4,5,*,2,3,4,5,2,3,4,5

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.國家貝類加工技術研發分中心,廣東湛江 524088;3.廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088;4.廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東湛江 524088;5.水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088)

水產品本身具有水分含量高、內源酶活力強等特點,容易發生腐敗變質,在長時間儲存或運輸過程中通常采用凍藏來保證品質不發生劣變[1]。產品在長期凍藏過程中,低溫會導致肌肉蛋白質(主要是肌原纖維蛋白)發生冷凍變性,而冷凍變性致使水產品口感風味改變及營養價值降低[2-3],在工業生產中使用抗凍劑如含磷抗凍劑及糖類抗凍劑來解決該問題。但含磷抗凍劑如多聚磷酸鹽類,與體內鈣質結合會造成鈣磷失衡[4],傳統糖類抗凍劑如蔗糖因甜度高、熱量高等特點,會影響產品風味[5]。

研究表明,蛋白質水解后產生的多肽可以有效抑制水產品冷凍變性,同時具有較低的甜度[6]。目前抗凍多肽主要來源有各種魚類蛋白如鱈魚肉[7]、各種動物皮膚中的膠原蛋白、明膠[8]、蝦的邊角料[9]等,但這些原料受到來源及提取條件等因素的限制,還不能達到商業化應用的程度。南極磷蝦(Antarctic krill)生物資源量巨大[10],具有抗菌、降血壓、抗氧化及抗疲勞耐缺氧等生物活性[11],而其冷凍保護研究較少,馬慶保等[12]研究發現,南極磷蝦適應極寒環境產生的抗凍蛋白具有冰晶生長抑制特性。因此,南極磷蝦蛋白是抗凍肽的一種潛在、良好的天然來源。

目前,研究抗凍多肽冷凍保護效果時,一般將其添加至魚糜或魚肉[13]中,而貝類冷凍保護研究較少。而牡蠣近年來產量不斷增加,主要采用冷凍保鮮銷往全國,是目前一種重要的食用海產品[14]。因此本研究以南極磷蝦為原料進行酶解工藝優化,并將所得到的酶解產物添加至牡蠣肉中,通過測定牡蠣肉凍藏后失水率、鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase酶活力及總巰基含量變化,對其冷凍保護效果進行評價,為南極磷蝦高值化利用及研發新型抗凍劑提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍南極磷蝦 山東棗莊漁源水族;新鮮牡蠣 湛江東風市場;堿性蛋白酶(2.4 AU/g) 諾維信(中國)生物技術有限公司;胰蛋白酶(酶活力4000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力100000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力100000 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;溶菌酶(14300 Da)、維生素B12(1355.38 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(429.47 Da)、L-酪氨酸(181.19 Da) Sigma公司;超微量Ca2+-ATPase酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;Folin-酚試劑盒、二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB) 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 上海滬試化工有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 上海化學試劑有限公司;試劑 無特殊說明均為分析純。

VOPADEST450全自動凱氏定氮儀 廣州德資格哈特儀器有限公司;UV2550紫外分光光度計、LC20AD高效液相色譜儀 日本島津公司;FDU-1100真空冷凍干燥機 埃朗科技國際貿易有限公司;N-1100V-WB旋轉蒸發儀 上海埃朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦的酶解方法 參照張元元等[15]方法有所改動。將購買的南極磷蝦于室溫解凍6 h,清洗后取一定南極磷蝦按1∶5的料液比加入蒸餾水打碎后勻漿15 min,加入蛋白酶后調節pH,水浴加熱至所需溫度保溫酶解,在此過程中保持體系pH不變。酶解結束后,在100 ℃下加熱10 min滅酶,后于4 ℃、8000 r/min離心20 min。將上清液在真空度為0.1 MPa、溫度為50 ℃旋轉真空濃縮后進行真空冷凍干燥(-45 ℃、20 Pa),干燥完成后裝入密封袋中于4 ℃保存。

1.2.2 南極磷蝦酶解條件的優化

1.2.2.1 南極磷蝦酶解用酶篩選 參照張元元等[15]方法有所改動。選擇胰蛋白酶(37 ℃,pH8.0)、中性蛋白酶(50 ℃,pH6.0)、堿性蛋白酶(55 ℃,pH10)及木瓜蛋白酶(50 ℃,pH7.0),添加量為1.6%,酶解時間5 h,底物濃度為20%條件下進行酶解,以水解度為指標進行篩選。

1.2.2.2 單因素實驗 根據蛋白酶篩選實驗結果,固定條件為:酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、pH10、加酶量1.6%及底物濃度為20%,設置各因素水平為酶解溫度40、45、50、55、60 ℃;pH8、8.5、9、9.5、10;加酶量1.2%、1.6%、2%、2.4%、2.8%;酶解時間4.5、5、5.5、6、6.5 h。酶解具體方法按1.2.1進行,研究各因素對水解度的影響。

1.2.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎上,選取酶添加量、溫度、pH、酶解時間四個因素,以水解度為指標,進行四因素三水平正交試驗,確定最佳的酶解條件組合。

表1 堿性蛋白酶水解正交試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels codingTable for alkaline protease hydrolysis orthogonal test

1.2.3 水解度的測定方法 水解度的計算公式為:

水解度DH(%)=酶解液中游離氨基態氮的含量(g)/原料中總氮×100

式中:原料中總氮為用凱氏定氮法測定樣品中的總氮含量[16];酶解液中游離氨基酸態氮為用甲醛滴定測定的酶解液中游離氮含量[17]。

1.2.4 南極磷蝦酶解產物分子量測定 參照李婉等[18]方法稍作修改,采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)進行分子量測定。色譜條件:流動相為Tris-HCl緩沖液(pH8.3、0.05 mol/L);色譜柱:Waters Protein-pak 60A(WAT085250);洗脫速度0.7 mL/min;25 ℃柱溫。樣品稀釋后上樣,上樣量20 μL,檢測波長214 nm。標準品為:維生素B12(1355.38 Da)、溶菌酶(14300 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(429.47 Da)、L-酪氨酸(181.19 Da)。以保留時間(t)為橫坐標和分子量的對數lgM為縱坐標作圖,得到分子量回歸方程為:lgM=-0.4567t+8.9462(R2=0.9976)。

1.2.5 南極磷蝦酶解產物的冷凍保護作用研究

1.2.5.1 凍藏牡蠣預處理 將新鮮牡蠣洗凈去除雜質,取出牡蠣貝肉4 ℃蒸餾水清洗后切成大小均勻的塊狀。將得到的牡蠣肉分成三份,按照牡蠣肉重量的0.5%添加復合磷酸鹽混勻為含磷抗凍劑組;按照牡蠣肉重量的5%添加南極磷蝦酶解產物粉末混勻為南極磷蝦酶解產物組;不經任何處理為空白對照組。將樣品放進-75 ℃的冰箱速凍2 h轉移至-18 ℃的冰箱中進行冷凍保藏。

1.2.5.2 解凍失水率測定 按照俞裕明等[19]的方法測定解凍失水率:將經過凍藏牡蠣肉取出在4 ℃冰箱放置12 h進行解凍,用濾紙吸干表面水分進行稱重,并按照下式計算解凍失水率:

1.2.5.3 鹽溶性蛋白提取及含量測定 基于萬建榮[20]的方法稍作修改:準確稱取3 g解凍后的牡蠣肉加入30 mL磷酸鹽緩沖液(I=0.05,pH=7.5)研磨提取5 min后,于4 ℃、8000 r/min下離心15 min,除去上清液,再次加入磷酸鹽緩沖液研磨提取離心,重復三次。在離心后得到的沉淀中加入30 mL的pH7、0.6 mol/L NaCl溶液,混勻后在4 ℃冰箱中提取20 h于4 ℃、8 000 r/min下離心15 min,所得上清液即為鹽溶性蛋白溶液。采用Folin試劑盒對上清液進行蛋白質含量測定,所得結果即為樣品中鹽溶性蛋白的含量。

1.2.5.4 總巰基含量測定 參照Benjakul[21]方法,取0.5 mL鹽溶性蛋白溶液加入試管中,然后加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(含有8 mol/L尿素、2% SDS、10 mmol/L EDTA、pH=6.8),取4 mL混合液加入0.4 mL 0.1% DTNB溶液(溶于0.2 mol/L的Tris-HCl中,pH=8.0),混勻后40 ℃水浴加熱25 min,在412 nm處測定吸光值。空白組以0.6 mol/L NaCl溶液代替樣品。按下列公式計算總巰基含量(mol/L)。

式中:A-樣品在412 nm處的吸光值;D-稀釋倍數;ε-摩爾消光系數13600/(mol·L-1·cm)。

1.2.5.5 Ca2+-ATPase酶活力測定 采用超微量Ca2+-ATP試劑盒對牡蠣肉提取的鹽溶性蛋白進行Ca2+-ATPase酶活力測定,按下列公式進行計算:

式中:其中A表示樣品測定管吸光值;B表示對照管吸光值;C表示標準管吸光值;D表示空白管吸光值。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0軟件和Excel 2010軟件對數據進行分析處理,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦酶解蛋白酶篩選結果

選擇胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶分別在其最適條件下對南極磷蝦進行酶解,以水解度為評價指標,四種酶水解度如圖1所示。由圖1可知,在最適條件下堿性蛋白酶的水解度最高,為10.94%±0.4%,顯著(P<0.05)高于木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶,其他三種酶的水解度無顯著性差異,因此選用堿性蛋白酶作為實驗用酶。

圖1 各種蛋白酶水解效果比較Fig.1 Comparison of efficiency of hydrolysis of different proteases注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 酶解溫度對南極磷蝦酶解水解度的影響 酶解溫度對南極磷蝦酶解水解度的影響結果如圖2所示。由圖2可知,隨著溫度的升高,酶解液的水解度先增加后降低,水解度在55 ℃時最大。在溫度低于55 ℃時,堿性蛋白酶的催化速率隨著隨溫度上升而增加,因此水解度出現上升;當溫度超過最適溫度范圍時,蛋白酶高溫變性以及酶解產物的增加抑制酶解反應的進行[22],導致水解度降低,因此選擇的水解溫度為55 ℃。

圖2 酶解溫度對南極磷蝦酶解水解度的影響Fig.2 Influence of enzymatic temperature on hydrolysis degree of Antarctic krill

圖3 pH對南極磷蝦酶解水解度的影響Fig.3 Influence of pH on hydrolysis degree of Antarctic krill

2.2.2 pH對南極磷蝦酶解水解度的影響 pH對南極磷蝦酶解水解度的影響結果如圖3所示。由圖3可知,隨著pH的增加,酶解液的水解度呈現先上升后下降趨勢,在pH為8.5時水解度最高。這是因為酶與底物的結合和催化反應常取決于底物和酶分子的電荷分布,pH變化影響酶與底物電荷分布,從而影響酶解反應的進行,過酸或過堿均影響蛋白酶活性[23]。在pH超過8.5時,蛋白酶活性下降,從而使水解度出現下降。因此,堿性蛋白酶酶解南極磷蝦最佳pH為8.5。

2.2.3 加酶量對南極磷蝦酶解水解度的影響 加酶量對南極磷蝦酶解水解度的影響如圖4所示。由圖4可知,隨著加酶量的增加,南極磷蝦水解度上升,在添加量為2.4%時,水解度最高,但加酶量繼續增加時水解度下降。這是因為體系內酶解效率隨著酶添加量的增加而提高,酶解效率逐漸升高;隨著酶添加量的繼續增加,反應體系出現酶過剩的現象,抑制酶解反應的進行[23],同時增加實驗成本,因此最佳加酶量為2.4%。

圖4 加酶量對南極磷蝦水解度的影響Fig.4 Influence of enzymatic dosage on hydrolysis degree of Antarctic krill

2.2.4 酶解時間對南極磷蝦酶解水解度的影響 酶解時間對南極磷蝦酶解水解度的影響結果如圖5所示。由圖5可知,水解度隨著酶解時間的增加先升高后下降,在5 h時水解度最高。這是因為,隨著反應的進行,酶與底物逐漸結合,催化反應向正方向進行,水解度不斷增加,但隨著反應的繼續進行,酶解產物濃度增加,競爭性抑制作用變強,新生成的小分子肽、氨基酸等產物使催化反應向逆反應方向進行[24],造成水解度下降。因此最佳酶解時間為5 h。

圖5 酶解時間對南極磷蝦酶解水解度的影響Fig.5 Influence of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree of Antarctic krill

2.3 南極磷蝦酶解正交試驗優化結果

在單因素實驗結果基礎上,以水解度為指標選用四因素三水平的正交試驗(見表1)對南極磷蝦酶解工藝條件進一步優化,試驗優化結果如表2所示。由直觀分析法得出,時間、加酶量、溫度及pH四個因素對水解度均有影響,根據極差R值分析顯示各因素對水解度影響大小為:加酶量>pH>酶解溫度>酶解時間,即加酶量對實驗影響最大。正交優化得到最佳酶解工藝參數為:A2B2C3D2,即pH8.5,酶解溫度為55 ℃,加酶量2.6%,酶解時間為5 h。此條件不在正交表中,進行驗證實驗得到在此條件下的水解度為23.85%±0.95%。

2.4 南極磷蝦酶解產物相對分子質量分布

南極磷蝦酶解產物相對分子質量分布結果如表3和圖6所示。南極磷蝦酶解產物相對分子質量主要分布在100～5500 Da,占總酶解產物的79.69%。與李曉坤、孫麗潔等[25-26]的研究結果一致。李曉坤[25]研究得到的抗凍多肽分子量分布在150～2000 Da;孫麗潔等[26]得到的抗凍多肽分子量主要分布在小于3000 Da。目前研究的結果表明抗凍多肽相對分子質量較低,具有較強的抗凍活性,這可能是因為分子質量小的多肽更容易與冰晶表面結合,阻礙冰晶生長,而小分子肽也可以與水形成氫鍵,增強凍結過程水的穩定性,減少大冰晶的形成[27]。因此經過工藝優化得到的南極磷蝦酶解產物可能具有一定的抗凍活性。

表3 南極磷蝦酶解產物相對分子質量分布表Table 3 Molecular weight distribution of the enzyme hydrolysate of Antarctic krill

圖6 南極磷蝦酶解產物相對分子質量分布圖Fig.6 Molecular weight distribution of the enzyme hydrolysate of Antarctic krill

2.5 南極磷蝦酶解產物對牡蠣肉的冷凍保護作用

2.5.1 凍藏過程中各處理組牡蠣肉解凍失水率變化 如圖7所示,各樣品組隨著凍藏時間的增加,均出現失水現象。這是因為牡蠣肉在凍藏過程形成冰晶,導致組織結構受損,解凍后的水分不能被其組織全部吸收,從而造成部分汁液流失[28]。凍藏10 d時,各處理組的失水率之間差異不顯著,隨著凍藏繼續進行,凍藏25 d后空白對照組的失水率為10.11%,添加量0.5%的含磷抗凍劑組和添加量為5%酶解產物均可以抑制牡蠣肉失水現象,其失水率分別為6.56%、5.00%。添加量0.5%含磷抗凍劑組及添加量5%酶解產物組失水率極顯著低于空白對照度(P<0.01),而酶解產物組抑制效果明顯優于含磷抗凍劑組。這是因為南極磷蝦酶解產物中含有小分子肽能夠與水結合,增強凍結過程中水的穩定性,有效提高牡蠣肉持水能力。

圖7 不同凍藏時間下各處理組牡蠣肉解凍失水率的變化Fig.7 Changes of thawing water loss rate of oyster meat in each treatment group under different freezing time注:與空白對照組相比,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)；圖8～圖10同。

2.5.2 凍藏過程中各處理組牡蠣肉鹽溶性蛋白含量變化 鹽溶性蛋白是肌肉蛋白質的主要組成部分,因此鹽溶性蛋白可以反映牡蠣肉蛋白質的特性,其含量越低表示蛋白質變性程度越大[29]。隨著凍藏時間的延長,牡蠣肉鹽溶性蛋白含量變化如圖8所示,凍藏5 d時,牡蠣肉鹽溶性蛋白含量下降劇烈,各處理組之間無顯著性差異,繼續凍藏鹽溶液蛋白含量下降趨勢變緩。凍藏25 d后空白對照組樣品鹽溶性蛋白含量為0.55 mg/mL,下降55%,添加量為0.5%含磷抗凍劑組及添加量為5%的酶解產物組鹽溶性蛋白含量分別為0.51、0.77 mg/mL,分別下降58.53%、37.39%,南極磷蝦酶解產物組極顯著高于空白組及含磷抗凍劑組(P<0.01)。這與Yanan[30]研究結果一致,結果表明南極磷蝦酶解產物具有一定的抑制牡蠣肉蛋白質冷凍變性的效果,在添加量為5%時作用效果優于添加量為0.5%的市售含磷抗凍劑。

圖8 不同凍藏時間下各處理組鹽溶性蛋白含量變化Fig.8 Changes of salt soluble protein in each treatment group under different freezing time注：與含磷抗凍劑組相比，Δ表示差異顯著(P<0.05);ΔΔ表示差異極顯著(P<0.01)，圖9同。

2.5.3 凍藏過程中各處理組牡蠣肉中總疏基含量的變化 巰基是蛋白質中最為活躍的基團,在凍藏期間,肌球蛋白的冷凍變性導致蛋白質結構改變,從而使其活性巰基暴露被氧化成二硫鍵,造成總巰基含量下降[31]。各處理組牡蠣肉凍藏過程中總巰基含量變化如圖9所示,隨著凍藏時間的增加,牡蠣肉中總疏基含量逐漸減少,表明牡蠣肉蛋白質發生了一定程度冷凍變性。凍藏25 d后,空白對照組總巰基含量下降至0.300×10-5mol/L,下降65.51%;添加量為0.5%的含磷抗凍劑組和添加量為5%南極磷蝦酶解產物組分別下降至0.312×10-5、0.434×10-5mol/L,分別下降64.13%、50.11%,空白組下降程度最大,添加南極磷蝦酶解產物組總巰基含量極顯著高于空白組和含磷抗凍劑組(P<0.01)。結果顯示,與空白對照組及添加量為0.5%的含磷抗凍劑相比,添加量為5%的南極磷蝦酶解產物總巰基含量下降率最低,抑制效果最好。因此,酶解產物能一定程度抑制牡蠣肉凍藏過程中發生蛋白冷凍變性。

圖9 不同凍藏時間下各處理組總巰基含量變化Fig.9 Changes of the total sulfhydryl groups in each treatment group under different freezing time

2.5.4 凍藏過程中不同處理組牡蠣肉中Ca2+-ATPase酶活力變化 水產品凍藏過程中由于肌球蛋白頭部巰基的氧化會導致Ca2+-ATPase酶活力下降,測定Ca2+-ATPase酶活力的變化可以監測水產品凍藏過程蛋白質變性情況[32]。如圖10所示,牡蠣肉經過凍藏后,三個處理組樣品的Ca2+- ATPasease酶活力均出現降低。凍藏25 d時,空白對照組由最開始的0.41 μmol Pi/mg prot/h下降至0.05 μmol Pi/mg prot/h,下降幅度為87.8%,添加0.5%含磷抗凍劑組和添加量為5%南極磷蝦酶解產物組分別降至0.11 μmol Pi/mg prot/h,0.12 μmol Pi/mg prot/h,分別下降73.17%、70.73%,含磷抗凍劑及南極磷蝦酶解產物的Ca2+-ATPasease酶活力極顯著高于空白對照組(P<0.01),南極磷蝦酶解產物可以保持牡蠣肉凍藏過程蛋白質分子結構的穩定,抑制Ca2+-ATPase酶活力下降,能在一定程度上抑制牡蠣在凍藏過程發生冷凍變性。

圖10 不同凍藏時間下各處理組Ca2+-ATPase活性的變化Fig.10 Changes of Ca2+-ATPase activity in each treatment group under different freezing time

3 結論

以南極磷蝦為研究對象,對酶解用酶進行篩選得到堿性蛋白酶酶解效果最佳。堿性蛋白酶正交優化得到最佳酶解條件為酶解溫度為55 ℃,酶解pH為8.5,加酶量2.6%,酶解時間為5 h,此時水解度為23.85%。此條件下南極磷蝦酶解產物分子量分布100～5500 Da,占總酶解產物的79.69%。將酶解產物按5%比例添加至牡蠣肉中,經過凍藏25 d后,添加量為5%的南極磷蝦酶解產物組的牡蠣肉失水率低于空白對照組及添加量為0.5%的含磷抗凍劑組;抑制鹽溶性蛋白含量及總巰基含量下降效果優于含磷抗凍劑組;Ca2+ATPase酶活力與含磷抗凍劑組相似,且高于空白對照組。因此南極磷蝦堿性蛋白酶酶解產物對牡蠣肉具有較好的冷凍保護活性,具有開發成安全高效無磷抗凍劑的潛在前景。