桑辛素對D-半乳糖致小鼠老年性癡呆模型的保護作用及機制研究*

鐘芳芳，嚴鳴光，楊 芳，朱 格，殷衛兵

（商丘市第一人民醫院，商丘 476100）

老年性癡呆（阿爾茨海默病，AD）是一種常發生于老年期，以記憶缺失，進行性認知功能障礙為主要臨床特征的神經退行性疾病[1]。目前認為AD主要的病理學改變為神經原纖維纏結、老年斑和大量的神經元丟失[2]。近年來，隨著人均壽命的逐漸增加和人口老齡化日益嚴重，AD已成為繼心血管疾病、腫瘤和中風之后的第4大死亡原因[3]。AD的發病機制尚不明確，近年來研究顯示AD與膽堿能神經系統、炎癥和氧化應激等密切相關[4]。目前醫學界對AD的防治尚無理想藥物。桑辛素是桑葉中的一種分子量為420.461的黃酮類化合物，研究表明其具有抗炎、抗衰老、抗菌、抗病毒和降血糖等廣泛的藥理作用[5]。它的抗炎機制可能與調節NF-κB信號轉導通路有關，而抗衰老機制則與其可清除氧自由基作用有關。目前桑辛素對老年性癡呆的研究尚未見相關文獻報道，本研究旨在探討桑辛素對老年性癡呆的保護作用及其作用機制，為桑辛素的進一步開發和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 桑辛素：含量≥98%，上海士鋒生物科技有限公司，批號：62596-29-6；D-半乳糖：國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160714；吡拉西坦片：規格：0.4 g/片，湖北華中藥業有限公司，批號：20160830。乙酰膽堿（ACH）、乙酰膽堿轉移酶（ChAT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20170620、20170511。白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒：博士德生物技術有限公司，批號：20170221、20170421；蘇木精-伊紅（HE）染液，南京建成科技有限公司，批號：20170412。p53鼠多克隆抗體：北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20170405。

1.2 動物 SPF級Balb/c小鼠60只，雌雄各半，體質量為20～24 g，購買于廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（粵）2016-0003。飼養條件：相對濕度為50%～70%，溫度為21～23℃，明暗各12 h。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥 小鼠按體質量隨機分為空白對照組、模型組、吡拉西坦組（PRT）、桑辛素低劑量組（MRS-L組）、桑辛素中劑量組（MRS-M組）、桑辛素高劑量組（MRS-H組），每組10只。連續8周皮下注射D-半乳糖100 mg/（kg·d）造模，造模當天開始連續給藥8周，其中PRT組灌胃給藥0.75 g/（kg·d），桑辛素低、中、高劑量組分別灌胃給藥10、20、40mg/（kg·d），空白對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.3.2 Morris水迷宮 實驗方法主要參照文獻[6]，具體實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，定位航行實驗：每次實驗將小鼠分別從1、3、4象限中點放入水池，記錄小鼠找到平臺的時間，即為潛伏期，假如小鼠在1 min內仍未找到平臺，需引導小鼠到平臺上停留25 s，并記錄其潛伏期按1min，連續4 d。第5天撤掉平臺，進行空間探索實驗，記錄小鼠60 s內通過平臺的次數以及分析小鼠尋找平臺的策略。

1.3.3 腦組織海馬齒狀回結構病理學變化 4%多聚甲醛固定腦組織，自來水流水沖洗24 h，75%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片和常規HE染色，片厚為5μm，觀察腦組織海馬齒狀回結構病理學變化。

1.3.4 生化指標檢測 采用ELISA檢測方法檢測血清TNF-α和IL-1β的含量。取腦組織，制成10%勻漿，測定ChAT活性和ACH含量。實驗操作均嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。

1.3.5 p53蛋白表達的檢測 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法，首先采用二喹啉甲酸（BCA）法定量檢測腦組織勻漿蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離目的蛋白，濕法轉膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，分別加入一抗（1∶900）和內參 β-action（1∶4 000），4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶4 000），ECL試劑盒顯色檢測蛋白條帶。以β-action灰度值作為內參照，采用quantity one Image J軟件進行圖像灰度值分析。

1.3.6 統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，各組不同時點比較采用重復測量方差分析表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠學習記憶能力的影響 本實驗采用Morris水迷宮實驗方法，分別通過定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，檢測各組小鼠的空間學習能力和空間探索能力。結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠尋找到平臺的潛伏期顯著延長（P＜0.05或 P＜0.01），穿越平臺所在位置的次數顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），探索策略也多采用趨向式。與模型組比較，PRT組和桑辛素給藥組小鼠找到平臺的潛伏期均顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），穿越平臺所在位置的次數顯著增多（P＜0.05或 P＜0.01），探索策略也多采用直線式。與MRS-L組比較，MRS-H組和PRT組小鼠找到平臺的潛伏期均顯著降低（P＜0.05），穿越平臺所在位置的次數顯著增多（P＜0.05），探索策略采用直線式較多。見表1-2。

表1 各組小鼠空間學習能力結果（x±s）Tab.1 Resultsof space learning capability of mice in each group（x±s）

表2 各組小鼠空間探索能力結果（x±s）Tab.2 Results of space exploration capability of mice in each group（x±s）

2.2 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠腦組織海馬齒狀回結構的影響 本實驗通過石蠟切片、HE染色方法觀察各組小鼠腦組織海馬齒狀回病理學變化。結果顯示，空白對照組海馬齒狀回神經細胞結構完整，飽滿，細胞核大而圓，核仁清晰。模型組海馬齒狀回神經細胞排列散亂，胞漿濃縮，核固縮，而PRT組和MRT給藥組神經細胞排列較整齊，神經細胞形態結構較完整，神經細胞凋亡情況明顯改善。見圖1。

2.3 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠血清TNF-α和IL-1β含量的影響 本實驗采用ELISA檢測方法，分別檢測各組小鼠血清TNF-α和IL-1β含量。結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α和IL-1β含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，PRT組和MRS給藥組小鼠血清TNF-α和IL-1β 含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與 MRS-L組比較，MRS-H組和PTR組小鼠血清TNF-α和IL-1β 含量明顯降低（P＜0.05）。見圖 2-3。

2.4 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠腦組織ChAT活性和ACH含量的影響 本實驗采用ELISA檢測方法，分別檢測各組小鼠腦組織ChAT活性和ACH含量。結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠腦勻漿ChAT活性和ACH含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，MRS-M組和MRS-H組小鼠腦勻漿ChAT活性和ACH含量明顯升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。見圖 4-5。

圖1 各組小鼠腦組織海馬齒狀回結構觀察（HE，×20）Fig.1 Observation of hippocampal dentate gyrusstructure of mice in each group（HE，×20）

圖2 各組小鼠血清TNF-α含量（x±s）Fig.2 Content of TNF-α in serum of miceineach group（x±s）

圖3 各組小鼠血清IL-1β含量（x±s）Fig.3 Content of IL-1β in serum of micein each group（x±s）

圖4 各組小鼠腦組織ChAT活性（x±s）Fig.4 Activity of ChAT in brain of mice in each group（x±s）

2.5 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠腦組織p53表達的影響 本實驗采用Western blot檢測方法，檢測腦組織中p53蛋白的表達水平。結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠腦組織p53表達量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，PRT組和MRS給藥組小鼠腦組織p53表達量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與MRS-L組比較，MPS-H組和PRT組小鼠腦組織p53表達量明顯降低（P＜0.01）。見圖6-7。

圖5 各組小鼠腦組織ACH含量（x±s）Fig.5 Content of ACH in brain of mice in each group（x±s）

圖6 各組小鼠腦組織p53表達Fig.6 Expression of p53 in brain of micein each group

圖7 各組小鼠腦組織p53表達（x±s）Fig.7 Expression of p53 in brain of mice in each group（x±s）

3 討論

AD是一種常發生于老年期，以記憶缺失進行性認知功能障礙為主要臨床特征的神經退行性疾病。AD發病機制異常復雜，迄今尚無完全闡明，而且藥物治療效果有限，不良反應較多。故針對AD的防治已成為當今醫學研究中的重要內容之一。目前針對AD的臨床治療主要采用乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲、大腦神經細胞類保護劑吡拉西坦和抗氧化劑維生素E等藥物。吡拉西坦廣泛應用于臨床AD防治，也多用于AD動物模型的實驗研究[7]，故本實驗選用吡拉西坦作為陽性藥物進行研究。

Morris水迷宮的定位航行實驗和空間探索實驗是分別評價學習能力和記憶能力的經典方法[6]。本研究發現模型組小鼠Morris水迷宮定位航行實驗的潛伏期明顯延長，穿越平臺的次數減少，多采用趨向式的探索策略，提示模型組小鼠的學習能力和記憶能力均受到損害，也表明了D-半乳糖致老年性癡呆小鼠造模成功，而桑辛素給藥組小鼠上述指標較模型組明顯改善，呈劑量依賴性，提示桑辛素可明顯改善AD小鼠的學習能力和記憶能力。而模型組小鼠海馬齒狀回神經細胞損傷嚴重，桑辛素給藥組小鼠海馬齒狀回神經細胞損傷明顯改善，間接提示AD模型的成功和桑辛素明顯改善腦海馬齒狀回的神經損傷。炎癥是AD重要的發病機制之一，TNF-α和IL-1β是兩個重要促炎因子，參與AD的發生發展過程。AD開始階段，TNF-α可激活星形膠質細胞和小膠質細胞，誘導分泌大量IL-1β，引起一系列的炎癥級聯反應[8]。本研究發現桑辛素給藥組可明顯抑制AD的炎癥反應，從而減輕AD的炎癥損傷。膽堿能神經功能低下是AD另一重要的發病機制，乙酰輔酶A在ChAT的催化下結合膽堿生成ACH，作用于腦組織中的膽堿受體，引起機體一系列的生理功能變化[9-10]。通常AD患者腦內ChAT活力下降，ACH合成不足。本研究發現桑辛素可明顯提高腦內ChAT活力和ACH的含量，加強膽堿能神經功能。p53是機體內的一種抑癌基因，Aβ可直接激活p53，激活的p53被磷酸化生成p-p53，進而參與細胞凋亡的調節[11-12]。本研究發現桑辛素可明顯抑制腦內p53的表達，抑制神經細胞的凋亡。

綜上所述，桑辛素對D-半乳糖致AD小鼠具有較好的保護作用，其作用機制可能與減輕炎癥、抑制神經細胞的凋亡和增加神經突觸間的ACH含量和ChAT活性有關。