不同地方豬種背部皮下脂肪中m iR-206差異表達研究

陶 璇，顧以韌，楊雪梅，梁 艷，何志平，鐘志君，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，王 言，龔建軍，應三成，呂學斌

（四川省畜牧科學研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066）

miRNA是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，通過結合靶基因mRNA的3′UTR，降解靶miRNA或阻止蛋白質翻譯，在轉錄后負調控基因的表達，是基因表達的重要調控因子，在細胞增殖、分化、發育、代謝、凋亡和腫瘤轉移等多種生物學過程中起著重要作用[1]。近年來研究發現，miRNAs與豬脂肪細胞的生長、分化和增殖密切相關[2]。其中，miR-206主要參與細胞生長、增殖、凋亡以及細胞遷移等的調控，是肌肉特異表達的miR-1家族成員之一，早期的研究表明，miR-206參與肌肉的生成[3]，近年來發現miR-206與多種腫瘤的發生發展密切相關，可作為一種腫瘤抑制基因[4]；但miR-206與脂肪細胞的分化、增殖相關的研究還未見報道。

鑒于此，本試驗以四川省6個地方豬種丫杈豬、內江豬、成華豬、青峪豬、雅南豬、藏豬為研究對象，采用熒光定量PCR技術檢測miR-206在不同豬種背部皮下脂肪中的表達差異情況，為進一步探明不同豬種脂肪沉積能力及肉質差異形成的分子機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年4—10月在四川省畜牧科學研究院種豬科研基地進行。6個四川省地方豬種包括丫杈豬、內江豬、青峪豬、雅南豬、成華豬、藏豬，每個豬種隨機選取3頭健康斷奶仔豬（30日齡），共計18頭，同一時間開始組建群體，相同品種同欄飼養，采用相同營養水平和飼喂方式，達到6月齡進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數3～4肋骨間對應處的背部皮下脂肪組織。

1.2總RNA提取和QRT-PCR

脂肪組織的RNA按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen,China)的操作說明書提取，QRT-PCR采用miScriptⅡRT Kit（Qiagen，China）根據操作說明將RNA轉錄成cDNA，采用miScript SYBR?Green PCR Kit（Qiagen，China）在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進行熒光定量檢測，每個反應體系20μL。以5S、18S和U6作為熒光定量PCR的內參基因，引物信息見表1。所有目的mRNA定量結果均通過熔解曲線分析驗證PCR產物的特異性，確保產物無引物二聚體，每個樣本重復3次，每次檢測含3個陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達量。

表1 引物信息

1.3 數據統計分析

運用GeNorm軟件計算看家基因的歸一化因子NF（Normalization factor）值，以目的基因的拷貝數與對應樣本的NF值的比值表示基因的相對表達量。采用SigmaPlot 12.5軟件對性狀指標和基因相對表達量進行統計分析（ANOVA），結果以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

由表2可知，藏豬miR-206相對表達量最高，成華豬次之，青峪豬最低；藏豬miR-206相對表達量顯著高于內江豬（P＜0.05），極顯著高于丫杈豬和青峪豬（P＜0.01）。

表2 不同豬種背部皮下脂肪miR-206相對表達量

3 討論

脂肪組織不僅是動物機體能量儲存的一種形式，還參與調節包括食欲和能量消耗等多個機體功能，對繁殖、炎癥和免疫反應等多個復雜的生理過程也有重要調控作用[5]。此外，脂肪還是影響豬經濟價值和肉質風味的重要因素[6-7]。因此，研究豬的脂肪代謝不僅有利于改善胴體和肉質性能，還有助于推動人類肥胖和代謝性疾病的研究。

為探明豬脂肪沉積性狀相關基因或調控因子差異表達的分子遺傳機理，近年來育種學家已在豬脂肪沉積的調控機理方面做了大量研究[8-9]，但這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發現和功能研究的深入，從轉錄后的miRNA水平探索豬脂肪沉積形成的分子機理成為了研究的熱點[2]，但相關報道仍然較少。研究發現，miR-193b、miR-365、miR-196a、miR-133a/b、miR-455在棕色脂肪形成中有重要作用[10-11]，miR-128也可通過靶向基因抑制前體脂肪細胞的增殖和分化[12-14]。Wang等[15]研究發現，miR-206在1日齡榮昌豬背部皮下脂肪組織中高表達，之后30、90、240日齡表達水平急劇下降。

本試驗對四川省6個地方豬種背部皮下脂肪中miR-206的表達差異情況進行了研究，研究結果可為進一步探明miRNA在豬脂肪沉積中的作用提供參考。