一起豬流行性腹瀉病毒和豬鏈球菌混合感染引發仔豬拉稀病例的診斷及分析

劉 磊，盧冰霞，趙 碩，秦毅斌，段群棚，周英寧，蔣冬福，趙 武

（1.廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西農業職業技術學院，廣西 南寧 530007；3.廣西大學，廣西 南寧 530005）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種具有高度傳染性的豬腸道傳染病。其主要臨床特征為急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水死亡；各年齡段豬均易感，但危害最嚴重的是1周齡內的哺乳仔豬[1]。PEDV屬于甲型冠狀病毒屬的成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb[2]。1971年，在英國的豬群中PED首次被發現[3]，至今在全球主要養豬地區如歐洲、亞洲、北美洲等仍存在該病的影響。2010年以來，由PEDV變異毒株引起的，以高發病率和高死亡率為臨床特征的哺乳仔豬腹瀉（病死率達80%～100%）在中國豬群中大范圍暴發流行，造成了數百萬的哺乳仔豬死亡和巨大的經濟損失[4-5]。

豬鏈球菌病主要是由C、D、F、L、S、R等群鏈球菌引起一種人獸共患的傳染病，屬國家規定二類動物疫病[6]。1998—1999年江蘇暴發了發病率及死亡率高達50%左右的由R群2型豬鏈球菌（S.s2）感染引起的豬鏈球菌病，導致數萬頭生豬死亡，損失慘重[7]。豬鏈球菌病多呈地方性暴發，易感豬群發病率及死亡率均較高，感染后可導致豬發生腦膜炎、流產、關節炎、心內膜炎、支氣管肺炎等疾病，并可經發病豬感染人導致人的急性腦膜炎、感染性中毒休克綜合征和死亡等，嚴重危及人類健康和生命安全以及養豬業健康發展，是重要的公共衛生問題[8]。

2018年10月28日到2019年1月中旬，廣西一存欄1 000頭母豬場2～3日齡仔豬出現吐奶、水樣腹瀉、脫水等癥狀，發病率達80%，病死率可高達100%。1月25日豬場將其中2窩拉稀仔豬送往廣西獸醫研究所病毒研究室進行檢測，剖檢發現所有拉稀仔豬腸道腸壁變薄并充滿黃色液體，腸系膜淋巴結腫大出血，腦充血。實驗室檢測結果表明PEDV和S.s混合感染可能是引起本次仔豬拉稀的主要原因。現將該病例的檢測報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

拉稀仔豬2窩，每窩6頭，共12頭，由廣西某豬場送往本實驗室進行病原檢測。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產品；2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產品；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）為北京陸橋公司產品；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒為康為世紀公司產品；DL 2 000 DNA Marker為Takala公司產品。

1.3 引物

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PEDV和S.s等檢測引物，PCR擴增核苷酸片段大小預期為492 bp和294 bp。引物序列：PEDV-P1：5'-TTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3'、PEDV-P2：5'-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3'；S.s-P1：5'-CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT-3'、S.s-P2：5'-GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA-3'。

2 實驗室診斷

2.1 剖檢變化

對病死拉稀仔豬剖檢可見，腦充血、腸道腸壁擴張變薄內有黃色黏稠液體，腸系膜充血、出血，包括腸系膜淋巴結在內的多處淋巴結腫大出血（圖1），脾臟稍腫大。其它實質器官無明顯眼觀病理變化。

2.2 細菌分離及藥敏試驗

每窩仔豬隨機選取2頭用無菌接種環從拉稀仔豬腦、腎臟、脾臟、肺臟和腸系膜淋巴結取樣無菌接種到TSA鮮血瓊脂平板培養基上，放在37℃恒溫箱中培養24 h后，觀察細菌生長情況。用接種環挑取菌落進行涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡下觀察細菌形態。采用K-B涂布法測定分離菌株對常見藥物的敏感性。

2.3 病毒檢測

2.3.1 病料處理 每窩拉稀仔豬（3頭）混為一份進行處理，無菌條件下采取拉稀仔豬的腦、肝臟、肺臟和脾臟等部位按照1∶3比例添加滅菌的PBS溶液，用勻漿器進行研磨；拉稀仔豬糞便或腸道及其內容物，按照1∶10比例添加滅菌的PBS溶液，用勻漿器進行研磨；制得的懸液反復凍融3次；12 000 r/min離心5 min，取上清液用于下一步樣品病原DNA/RNA的提取。

2.3.2 樣品病原DNA/RNA的提取 處理好的組織病料和TSA鮮血瓊脂平板培養基上的培養物按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書進行樣品病原DNA/RNA提取。所獲得的DNA用于下一步的PCR反應或置于-80℃保存，備用；所獲得的RNA用于下一步的RT-PCR，或置于-80℃保存，備用。

2.3.3 樣品病原PCR/RT-PCR檢測 參考秦毅斌等[9]方法對常見腸道腹瀉病毒—PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PRoV）和豬丁型冠狀病毒（PDCoV）進行RT-PCR檢測。同時參考劉磊等[10]檢測方法對可能引起仔豬腹瀉的常見病毒如豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV2）和豬圓環病毒3型（PCV3）進行PCR/RT-PCR檢測。RT反應體系按照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒進行，總體積為20μL：5×RT Buffer 4μL，dNTPMix 4μL，Primer Mix 2μL，DTT 2μL，HiFiScript 1μL，RNA Template 7.0μL。cDNA合成反應條件：42℃，40 min，反應產物即用或-20℃保存備用。采用25μL PCR反應體系：2 x F8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 μL，25μmol/L上、下游引物各0.5μL，滅菌水8.5 μL，模板3.0μL。反應程序為：94℃3min，94℃10 s，退火溫度10 s，72℃10 s，30個循環；72℃10min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察結果。

3 結果

3.1 細菌分離培養、鏡檢和藥敏試驗結果

從4頭拉稀仔豬的腦和腸系膜淋巴結中分離培養出圓形隆起、灰白色、濕潤透明菌落，菌落周圍形成β型溶血環。挑取單個菌落涂片鏡檢，結果均呈革蘭氏染色陽性，菌體呈球形或橢圓形，并多呈短鏈狀或成對或單個排列（圖2）。藥敏試驗結果顯示：分離培養出的菌株對氧氟沙星、頭孢噻呋鈉、阿米卡星等藥物敏感，對青霉素、阿莫西林、鏈霉素、克拉霉素、卡那霉素等藥物耐藥。

3.2 組織樣品和細菌培養物PCR/RT-PCR檢測結果

混合的4份組織樣品PCR/RT-PCR檢測結果顯示，送檢的2窩腹瀉仔豬TGEV、PRoV、PDCoV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PCV3均為陰性，而PEDV均為陽性，結果見圖3和圖4。細菌培養物PCR檢測結果顯示，送檢的2窩腹瀉仔豬4份分離培養出的細菌均為S.s陽性，結果見圖5。將其中1份PEDV和S.s陽性PCR產物送生工生物（上海）工程有限公司進行測序，測序結果在NCBI里進行Blast，結果顯示PEDV陽性PCR產物測序所得的核苷酸序列與NCBI上登錄的2010年以后我國其它PEDV同源性在97.8%～99.7%之間，證明擴增的目的片段是PEDV基因片段，S.s陽性PCR產物測序所得的核苷酸序列與NCBI上登錄的S.s2同源性在99.2%～100%之間，證明擴增的是S.s2基因片段。因此從基因水平上進一步證實混合感染PEDV和S.s2是導致該豬場仔豬拉稀的主要原因。

4 防控措施

4.1 加強發病豬舍的飼養管理水平，對豬舍、環境、用具和運輸工具等均要進行徹底清掃消毒。發病豬舍一天消毒2次，使用百菌消1∶300稀釋或者過氧乙酸1∶500稀釋帶豬消毒，其它豬舍每天消毒1次。對病死豬及其糞污進行無害化處理。

4.2 用基于PEDV變異株的豬流行性腹瀉/豬傳染性胃腸炎二聯滅活疫苗對所有母豬進行緊急接種，并對產前7 d母豬進行加強免疫。同時使用豬鏈球菌多價滅活菌苗對豬群進行免疫。在母豬群飼料中添加黃芪多糖粉400 g/t，連用7 d；豬群飲水中添加500 g/t，連用7 d；母豬群使用長效頭孢10mL/頭，仔豬三針保健使用頭孢噻呋鈉粉針，使用劑量按照0.01mg/kg。對新生仔豬加強保溫等飼養管理措施。

經過采取上述防控措施，豬場仔豬拉稀疫情得以有效控制，沒有出現新病例。

5 小結與分析

2018年10月28日到2019年1月中旬，廣西一存欄1 000頭母豬場，2～3日齡仔豬出現吐奶、水樣腹瀉、脫水等癥狀，發病率達80%，病死率可高達100%。為確診引起該規模豬場新生仔豬拉稀死亡的病因，1月25日該豬場將其中2窩拉稀仔豬送往本實驗室進行綜合病原檢測。實驗室檢測結果表明：送檢的2窩拉稀仔豬PEDV和S.s2均為陽性。結合豬場的發病情況、臨床癥狀、剖檢病變以及實驗室檢測結果最終確診PEDV和S.s2混合感染是引起本次仔豬拉稀的主要原因。

在養豬生產中能夠引起仔豬拉稀的原因有很多，營養原因、應激原因以及疫病原因等均可能造成新生仔豬的拉稀和死亡。而在疫病方面，PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2等病原的感染均可能引起新生仔豬拉稀和死亡，而且在臨床癥狀上難以區別，因此發生疫情時，需要快速進行病原學鑒別診斷，以確定引起發病的原因，盡快制定及采取有效防控的針對性措施，平息疫情，減少損失。

由豬鏈球菌引起的豬腦膜炎性、敗血型鏈球菌病會引起病豬全身淋巴結腫大出血，破壞動物機體的免疫系統，豬腦膜炎型鏈球菌病的病豬腦膜充血還會造成豬嗜睡、昏迷等神經功能障礙。該豬場送檢的拉稀仔豬中除了檢測出PEDV外，還均檢測出S.s2感染，S.s2感染可能破壞了仔豬的免疫系統、加重了PED疫情并且降低了PED疫苗免疫效果，這可能是哺乳仔豬長時間腹瀉并造成大量死亡的主要原因。

S.s2對很多藥物具有耐藥性，因此通過藥敏試驗篩選敏感藥物是控制疫情的關鍵措施，藥敏試驗的結果顯示所分離的鏈球菌對青霉素、阿莫西林等藥物耐藥，僅對氧氟沙星、阿米卡星、頭孢噻呋鈉敏感。