國內外豬流行性腹瀉病毒和其他豬冠狀病毒疫苗研究進展

敖 翔，賴守勛，周建川，李元鳳，何 健

（1.四川鐵騎力士集團馮光德實驗室，四川 綿陽 621006；2.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010）

1 豬冠狀病毒

冠狀病毒在20世紀60年代中期首次被發現，隨后在人類、老鼠、豬和雞等許多物種體內被分離出來。這些病毒有一個共同的形態學特征，即其邊緣呈棒狀突出部，12～24 nm長，周圍是一種不規則形狀的60～220 nm病毒粒子，形似日冕[1]。冠狀病毒感染人類和各種動物，導致呼吸道、胃腸和神經系統疾病以及肝炎。突出的例子包括嚴重急性呼吸綜合征病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征病毒（MERSCoV）和貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）。

豬冠狀病毒可分為呼吸系統冠狀病毒（PRCoV））和腸狀病毒型冠狀病毒，如傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）。后者具有相似的流行病學、臨床和病理特征。目前，冠狀病毒科被分為4個類：α冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒。TGEV和PEDV屬于字母α冠狀病毒屬，而PDCoV屬于δ冠狀病毒屬。

冠狀病毒是具外套膜（envelope），單鏈的，陽性的RNA病毒，其最大的RNA基因組大約有30 kb。基因組RNA鏈含有5'和3'的未翻譯區（UTR），其中5'端有甲基化“帽子”，而3'端有PolyA“尾巴”結構。開放閱讀框（ORF）1a和ORF1ab占據了基因組的5'端2/3的區域，并編碼了兩個復制酶多蛋白（pp1a和pp1ab）。pp1ab蛋白的表達需要在基因組RNA翻譯過程中進行核糖體轉移。產生的多聚蛋白被木瓜樣蛋白酶（papainlike protease,PLP,nsp3）和3C樣蛋白酶（3CLpro,nsp5）降解成16個非結構蛋白（nsp1-nsp16）。3'端近三分之一的區域依次編碼了4種結構蛋白：S（刺突蛋白）、E（小包膜蛋白）、M（膜蛋白）、N（核蛋白）。一些β冠狀病毒含有一個額外的膜蛋白，即血凝素酯酶（HE）。這些基因之間的點綴是編碼輔助蛋白質的基因。輔助蛋白基因的數量在不同的冠狀病毒之間有所不同。例如，傳染性胃腸炎病毒（TGEV）有3個輔助蛋白基因，而豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）只有1個（圖1）。

病毒RNA基因組被N蛋白質包裹成螺旋狀核衣殼。除了結構上的作用，N蛋白還能延長S期細胞周期，誘導內質網應激，上調白細胞介素-8的表達和對抗Ⅰ型干擾素的產生[2-3]。S蛋白在病毒粒子表面形成了聚體，調節宿主受體結合和膜融合。它可以分為S1和S2亞結構域。在一些冠狀病毒中，S蛋白通過細胞蛋白酶或胰蛋白酶被加工成S1和S2片段[4-5]。S蛋白是病毒中和抗體的主要靶標[6-7]。M蛋白是最豐富的病毒粒子，也包含了保守的線性B細胞的表位[8]。E蛋白負責病毒粒子的裝配，它會導致內質網應激和上調白細胞介素-8的表達[9]。輔助基因對于體外的病毒生長來說是可有可無的，但是它們在感染宿主的病毒存活中扮演著重要的角色。實際上，TGEV輔助基因ORF7的產物降低了參與免疫系統抗病毒防御的基因表達，例如干擾素反應和炎癥[10]。PEDV的ORF3蛋白作為離子通道，它被認為與PEDV的毒性有關[11-12]。PEDV其中一種非結構蛋白，nsp1，被證明是一種Ⅰ型干擾素抑制因子[13]。有趣的是PDCoV缺少nsp1基因。

2 發病機理和臨床疾病

冠狀病毒主要感染Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞（PRCoV）或腸內絨毛和隱窩上皮細胞（TGEV、PEDV和PDCoV）。PEDV在小腸中也會感染杯狀細胞[14]。一些肺泡巨噬細胞和固有層巨噬細胞的感染已經證明了這一點，但并不是所有的豬冠狀病毒都如此[15-16]。病毒進入目標細胞的過程是由一系列受體配體相互作用調節的，包括硫酸肝素[17]和氨肽酶N（APN）[18-19]。重要的是，氨肽酶N的表達水平似乎與感染水平相關，至少對PEDV來說是如此。表達水平越高，感染越嚴重[18，20]。因此，在灌木叢中出生的含有較低APN的小豬可能比含有較高APN的小豬對PEDV更有抵抗力。

腸道感染TGEV和PEDV的特點是嚴重腹瀉、嘔吐和脫水，特別是在不到兩周的仔豬上有很高的發病率和死亡率。相比之下，呼吸冠狀病毒的感染會在所有年齡段的豬身上造成非常輕微和短暫的疾病，而這種疾病通常不會引起生產者的注意。除非并發感染很復雜，否則PRCoV感染只是短暫的咳嗽和呼吸困難。然而，PRCoV在與其他病原體共同感染的過程中會成為一個更重要的問題，例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）[21]。

PEDV腸細胞感染會導致絨毛萎縮，從而導致吸收不良、腹瀉和厭食。在感染24～48 h后，可能會出現嘔吐，通常不會持續超過2～3 d。根據病毒的劑量和仔豬的年齡，可以在感染24～36 h內發現腹瀉。腹瀉通常持續5～8 d，但可以持續更長時間，并導致嚴重的體重損失，通常在正常的生產周期中無法彌補。病毒的排出是在第3～5天之間，但也可能持續感染數天至數周后。幸存的仔豬在大約6～8 d的感染后開始恢復，通常是在絨毛上皮增生和絨毛再生的同一時間。同樣地，TGEV感染了絨毛腸細胞，并導致了在臨床上與PEDV無法區分的疾病。年輕的小豬死亡率最高，通常達到100%。相比之下，PDCoV的感染會在3～5周的時間里引起較輕微的仔豬感染。在受感染的動物身上可能出現腹瀉、嘔吐和厭食。一般來說，與PEDV和TGEV感染的動物相比，所表現出的癥狀要溫和得多。

3 豬冠狀病毒免疫

豬腸道內的冠狀病毒先天免疫反應是一種腸道中的快速抗病毒反應，包括干擾素、核因子kB和其他抗病毒分子的釋放[14，22-23]。豬可以產生3種干擾素[24]：Ⅰ型干擾素包括著名的IFN-α/β，由多達17個不同基因編碼而成；只有Ⅱ型干擾素為IFN-γ；Ⅲ型干擾素包括IFN-γ1（干擾素29，IL-29），IFN-γ2（IL-28A），IFN-γ3（IL-28B）和IFN-γ4[20，25-28]。它們的功能在豬身上是未知的。特別是Ⅰ型和Ⅲ型干擾素，是宿主用來對抗病毒感染的。作為回應，包括PEDV和TGEV在內的大多數病毒已經形成了逃避和干擾干擾素反應的策略。一些病毒蛋白（PEDV和TGEV），包括結構和非結構蛋白，已經確定了可以抑制干擾素反應。關于豬冠狀病毒逃避免疫的內容請參考Zhang等（2016）[20]的綜述。對豬腸冠狀病毒的適應性免疫反應是建立在分泌性抗體和細胞毒性T細胞的基礎上的。這些包括分泌的IgA抗體（SIgA），是由在黏膜組織固有層的抗體分泌細胞以及像在血清和間質組織中IgG和IgM這樣的系統性抗體產生，有些同類型抗體可以從黏膜上皮細胞中轉移到腔體內[22，29]。對豬冠狀病毒的細胞反應以T輔助細胞為特征，這些輔助細胞支持抗體和細胞毒性T細胞的產生，這些細胞的目標是病毒感染的上皮細胞。在豬身上，這些主要是?■細胞，大部分都可以在上皮細胞層中找到[30]。大多數T細胞的表位都位于刺突蛋白和冠狀病毒的核蛋白中[31-33]。另外，CD8+T細胞的表殼是在人類SARS-CoV的膜蛋白中發現的[34]。

在新生仔豬中，保護的主要機制是由乳源性免疫介導的。在哺乳期間，SIgA、IgG和IgM通過初乳和常乳被動地轉移給仔豬[35-38]。初乳主要含有IgG，它是由母豬血清產生，在出生后24～48 h內被仔豬吸收。分泌的IgA主要在常乳中，一般出生后3～4 d從初乳過渡到常乳[39]。SIgA是由乳腺的抗體分泌細胞產生的，Bohl等（1972a）[40]多年前發現這些細胞在妊娠末期由腸道轉移到乳腺。這也在其他物種上得到證實，此外也發現一些趨化因子（如CCL28等）負責吸收這些抗體分泌細胞到乳腺[41-45]。因此，為了提高母源性免疫水平，口服可能是母豬免疫最明顯的途徑。事實上，大多數腸道冠狀病毒的疫苗最初設計都是通過對母豬接種疫苗來誘導乳源免疫產生的，然而，目前大多數疫苗都是通過系統注射來實現的。在沒有有效的PEDV疫苗的情況下，許多生產商目前正在使用一種封閉獨立的豬舍，其中的妊娠母豬通過返飼感染活病毒。然而，免疫力的持續時間通常不超過幾年（表1），這取決于使用的疫苗類型，通常活疫苗會提供更持久的免疫力。即使在返飼后，免疫力也會在相對較短的時間內開始消退，通常還不到幾個月。對PEDV的乳源性免疫作用可參考Langel等（2016）[39]的綜述。除了抗體，初乳還含有先天的效應分子，如防御素、抗菌肽、白細胞介素和細胞因子[38，46-49]。

表1 豬腸冠狀病毒疫苗策略

冠狀病毒的交叉保護水平尚不清楚。就PEDV而言，Goede等報道7個月前感染了一種溫和PEDV的母豬所生的3日齡小豬對更致命的PEDV有免疫保護作用[50]。在這個試驗中，母豬在懷孕的第109天受到了一種更致命的PEDV病毒的攻毒，并且在3日齡時對小豬再次口服攻毒。沒有母豬顯示出明顯的臨床癥狀。仔豬口服1mL更致命的PEDV黏液攻毒。雖然每組仔豬的死亡率和發病率各不相同，但之前感染過PEDV的母豬所產仔豬的整體發病率和死亡率都降低了。

4 TGEV和其他冠狀病毒疫苗

在20世紀90年代，TGEV在全球范圍內造成了嚴重的經濟損失。因此一些疫苗技術被開發并商業化。通過對母豬的免疫，確定了乳源免疫的重要性[37，51]。然而，隨著世界上許多地方這種疾病消失，北美和歐洲現在市面上的疫苗越來越少（表2）。大多數目前的商業TGEV疫苗是在妊娠期間給母豬接種的活弱毒疫苗，以便為新生仔豬提供乳源免疫。這些疫苗通常是結合輪狀病毒，PEDV或大腸桿菌的二聯或三聯疫苗。試驗疫苗包括新型DNA疫苗、載體疫苗和重組疫苗（表1）。例如，豬腺病毒被用來提供TGEV刺突蛋白[52]。Yuan等用豬痘病毒來表達刺突蛋白的A表位[53]。DNA質粒由PEDV和TGEV生成，用于開發DNA疫苗[54]。重組蛋白（刺突和核蛋白）在細菌、酵母和植物中表達后被廣泛地應用為重組疫苗。這些都被用于評估在口服后對黏膜免疫的潛力。

表2 TGEV和PEDV疫苗

5北美PEDV疫苗

在美國，PEDV的第一個疫苗是由愛荷華州的Harris疫苗公司開發的，并在2013年獲得有條件許可證。最初被稱為iPED疫苗，其實基于SirraVaxSMRNA粒子技術平臺產生的一種截斷版本的PEDV刺突基因[55]，這是基于委內瑞拉馬腦炎病毒衍生的pVEK復制子載體。該技術是一種具有傳播缺陷的單周期RNA粒子技術，它被認為是針對樹突狀細胞的。一個較長版本的刺突基因是密碼子優化而來的，用于第二代被稱為“iPED plus”的疫苗，該疫苗現在在商業上可用作豬流行性腹瀉疫苗（RNA）。在3周的間隔內，肌注接種兩劑疫苗后，疫苗對青年豬產生免疫。免疫后的斷奶仔豬在受到來自臨床表現明顯仔豬腸道組織攻毒，其臨床癥狀（腹瀉）嚴重程度明顯降低，并在最初的72 h內減少了病毒的排出[56]。在后備母豬中，疫苗的效價進一步得到檢驗。在分娩前8、5和1周的3次接種后，兩組的仔豬在2～6 d的時間內都受到了103TCID50的攻毒（PEDV/CO/2013）。對照組的平均死亡率為91%，而接種疫苗組的平均死亡率為69%[57]。在之前感染PEDV的母豬中也發現了類似的結果。在第1周對仔豬的口服攻毒后，平均死亡率從對照組的59%減少到接種組的45%。最后，Greiner等用80頭之前感染PEDV的母豬評估了相關疫苗。接種疫苗的母豬初乳對S1蛋白有更高的抗體滴度，使豬的整體死亡率降低了3%[58]。

在美國，PEDV的第2種疫苗是由Zoetis開發的，2014年在有條件許可的情況下進行了商業化生產。該疫苗由一種用佐劑配制的滅活病毒組成。該疫苗在PEDV陰性母豬中進行測試，接種兩次，間隔3周，接種疫苗（n=23）或輔助安慰劑（n=3）。疫苗是安全和免疫原性的，可誘導產生針對整個病毒和刺突蛋白的中和抗體[59]。該疫苗還在PEDV陽性商業群體中進行了田間試驗。母豬（n=120）在分娩前5周和2周接種疫苗，對照組母豬（n=120）接種安慰劑。接種疫苗的母豬斷奶前由于PEDV導致的死亡率從6.3%（對照組）降低為0.6%（免疫組）。與對照組相比，接種疫苗的中和抗體滴度提高了約3倍，每頭母豬增加了1.8頭活仔[60]。

第3種疫苗是最近由加拿大的疫苗和傳染病組Intervac開發的。疫苗是基于由佐劑配制的滅活病毒。當在分娩前4周和2周接種血清反應陰性母豬時，在初乳和常乳中發現了高水平的中和PEDV抗體，并在接種母豬的仔豬血清中也發現了這一現象。仔豬在出生第5天口服300 pfu的PEDV分離CO 025。結果發現，95%接種母豬（n=83）的仔豬在感染后存活，并顯著減少了臨床癥狀、體重損失和病毒排出。與此相反，所有未接種疫苗母豬的仔豬表現出嚴重的臨床癥狀，包括體重損失和脫水，其中50%的仔豬在感染后6 d內死亡。這些結果在另外兩項臨床試驗中得到證實。在加拿大薩斯喀徹溫省的3個商業農場進行了一個涉及600多頭母豬的大規模田間試驗，以評估在不同遺傳、健康狀態和管理條件下疫苗的效價。該疫苗被證明是完全安全的，沒有發現包括注射部位反應和生殖并發癥在內的不良事件。有8%的母豬在分娩前一周被轉移至疫苗與傳染病組織—國際疫苗中心（VIDO-InterVac）的高防范圈舍用于評估疫苗的功效。出生5 d后口服攻毒，接種母豬的仔豬存活率明顯高于對照組[61]。對免疫期限的評估目前正在進行中。此外，在HEK293系統中表達了一種親和標記的PEDV S1蛋白，用于亞單位疫苗。當給妊娠母豬接種時，疫苗部分保護新生仔豬不被PEDV感染[62]。

6亞洲PEDV疫苗

自20世紀80年代初以來，包括中國、日本、泰國、中國臺灣、菲律賓、韓國和越南在內的幾個亞洲國家及地區都曾報道過PEDV疫情。2010年10月，中國暴發了大規模的嚴重PEDV疫情[63]。2013年底，日本、韓國和中國臺灣暴發了PEDV疫情[64]。PEDV全長基因組序列的系統遺傳學分析表明，PEDV可分為兩組：G1（經典型）和G2（場流行或大流行）。每一組可以進一步分成兩個子組：1a和1b，2a和2b。目前PEDV疫苗的低到中度有效性也有可能是由于疫苗和田間流行株之間的遺傳差異造成的[65]。

在疾病控制方面，1995年中國引入了一種滅活的雙聯TGEV和PEDV疫苗。2015年3月，一種三聯弱毒疫苗（PEDV、TGEV和豬輪狀病毒）也被批準。所有這些疫苗都是基于經典的CV777（G1-a）菌株，這些菌株可以在綠猴腎Vero細胞中生長并達到高抗體滴度。目前還沒有公布這些疫苗功效的數據。然而，de Arriba等（2002）[66]在仔豬11日齡時用兩種不同劑量的弱毒CV777菌株進行口服接種，并在3周后用同樣致命的PEDV毒株對其進行口服接種。攻毒后，接種過疫苗的仔豬在一定程度上受到了保護，而低劑量組中的25%和高劑量組中的50%仔豬在攻毒后沒有排出病毒。

自2010年冬天以來，中國就經歷了嚴重的豬流感疫情，對養豬業造成了巨大的打擊。這些暴發可以通過重新出現的新PEDV菌株來解釋。為了滿足行業需求，中國研究人員開發了一種雙聯（PEDV和TGEV）弱毒疫苗，其中含有PEDV株ZJ08（G1-b）和一種基于AJ1102株的雙聯弱毒疫苗（G2-b）。基于G2-b菌株的滅活二聯疫苗也已開發。這些疫苗目前正在進行臨床評估[67]。

在日本，PEDV83P-5（G1-a）株在Vero細胞中經過100代后被削弱[68]。隨后，這種菌株在日本和韓國被用作肌肉注射（IM）弱毒活疫苗（P-5V）。此外，兩種韓國毒性PEDV菌株（SM98-1 and DR-13）被序列細胞培養后被削減。削減的SM98-1菌株被用作肌注活或滅活疫苗，而DR-13被用作口服活疫苗。這種口服疫苗于2011年在菲律賓注冊和商業化。在韓國，在妊娠母豬上通常推薦使用多次接種疫苗程序（3或4次疫苗接種，順序為：在分娩前以2～3周為時間間隔，分別是肌注活苗-滅活苗-滅活苗或活苗-活苗-滅活苗-滅活苗[69]。

根據韓國的一項研究，商業疫苗的應用使感染一種致命的野生型PEDV的仔豬存活率從18.2%增加到80%。然而，所有疫苗都沒有顯著降低發病率和病毒排出[69]。此外，Song等（2007）[70]報告說，在肌注了DR-13PEDV疫苗的母豬中，母豬產下的哺乳仔豬死亡率降低了60%。

盡管在全國范圍內使用了商業疫苗，但在2013—2014年，韓國經歷了一場嚴重的豬流行性腹瀉（PED）流行病。在亞洲國家和北美，PEDV G2-b毒株是最近嚴重的PED流行疫情的元兇。考慮到這一事實，韓國研究人員[71]測試了一種基于序列培養的G2-b菌株KOR/KNU-141112/2014的滅活疫苗。在分娩前6和3周，妊娠母豬肌注了滅活的有佐劑疫苗。6日齡的仔豬用同源病毒攻毒。接種母豬的仔豬減少了發病率、死亡率，并迅速恢復了日增重。需要進一步的研究來評估這種疫苗對1～2日齡仔豬在田間條件下的效果。

在亞洲使用的所有商業疫苗都是傳統的弱毒活疫苗或滅活疫苗。然而，研究人員正在研究新一代的PEDV疫苗（表1）。例如，Hou等（2017）[72]在乳酸菌表面表達了PEDV核蛋白。妊娠母豬和小鼠口服和滴鼻接種重組L.casei產生了高水平的N特異性血清IgG和黏膜IgA。同樣地，Liu等（2012）[73]在重組L.casei中表達S1和核蛋白，并報道小鼠口服免疫后增強了黏膜和全身免疫反應。Meng等（2013）[54]在小鼠上對來自PEDV和TGEV的表達刺突基因的重組DNA質粒的免疫原性進行了評價。結果表明，重組DNA質粒增加了T淋巴細胞的增殖，增加了CD4+和CD8+T淋巴細胞的數量。此外，DNA疫苗使免疫小鼠體內的IFN-g含量較高。在免疫接種35 d后，重組DNA質粒攜帶TGEV和PEDV的全長S基因，刺激產生了較高水平的病毒中和抗體。Zhang等（2016b）[74]還構建了雙聯DNA疫苗聯合表達TGEV和PEDV的S基因。弱毒傷寒沙門氏菌用于豬口服疫苗。接種疫苗的豬表現出TGEV和PEDV特異性細胞和體液免疫反應。然而，本研究中未進行攻毒試驗。

也有關于在植物[75]和細胞系[76]中表達重組PEDV S蛋白片段的報道。以轉基因煙草植物為食的小鼠，表達了含有PEDV中和表位誘導的PEDV特異性抗體和細胞介導免疫反應的S蛋白片段。在另一項研究中，Oh等（2014）[76]建立了豬細胞系，可以穩定地表達出PEDV刺突蛋白的S1片段。妊娠母豬在分娩前6、4、2周內用純化和佐劑的蛋白肌注免疫3次。母豬在血清和初乳中產生了PEDV特異性中和抗體反應。一個4～5日齡的仔豬被隨機從分娩母豬中挑選出來，用于PEDV攻毒。接種母豬的仔豬表現出較低的發病率、死亡率和病毒排出。然而，攻毒仔豬試驗的樣本量太少，影響了關于有效保護新生兒仔豬的結論。

7 未來展望

隨著世界各地TGEV的消失，過去幾年來對TGEV疫苗的需求下降了。對于北美和歐洲，只有兩家主要的國際動物保健公司繼續提供TGEV疫苗。相比之下，包括中國和韓國在內的亞洲許多地區仍在應對TGEV疫情，目前仍有不同類型的疫苗。然而，2013—2014年，PEDV進入北美豬群，扭轉了這一局面，并加強了全球對有效疫苗的需求。冠狀病毒是一種重要的動物病原體，可以對多種物種產生毀滅性的影響。對于一個依賴生物安全的行業來說是有風險的，如果出現這種情況，可能會導致重大的經濟損失，就像過去兩年在北美看到的那樣。事實上，冠狀病毒的發展史顯示了大量的抗原變異，這可能導致對不同菌株感染的有限交叉保護。因此，重要的是要繼續研究新的PEDV變異株，它們可能在局部或全球通過抗原漂移（點突變）或抗原轉移（重組事件）出現。

只有通過使用疫苗才能有效地預防和控制PEDV和其他冠狀病毒。一種理想的疫苗可以預防新生仔豬的死亡和臨床疾病，這是受疾病和病毒排出影響最嚴重的年齡階段。由于乳源性免疫是一種關鍵的保護機制，通過配方（佐劑）和傳遞（黏膜）來提高常乳中的抗體水平至關重要。然而，在處理新菌株時，時間也是至關重要的，因為傳統的制造疫苗方法，如病毒隔離、失活或衰減可能是耗時的。因此，對下一代疫苗，如RNA粒子、DNA、亞單位和病毒載體方法的研究對于預防未來暴發的冠狀病毒疾病是至關重要的。