miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎齦溝液中的表達及臨床意義*

汪 瀟，張 斌，Hesham Al-Sharani(也門)，白 雪

錦州醫科大學附屬第一醫院口腔科(錦州 121000)

種植體周圍炎屬于種植體常見并發癥，發生率為4%～15%，炎癥進展迅速，可進一步發展為種植體周袋及種植體膿腫，造成種植體松動，因此盡早預防、診斷種植體周圍炎對于提高患者預后十分重要[1]。近期發現在牙周疾病及牙周炎中有較多微小RNA(miRNA，miR)異常表達[2-3]，而種植體周圍炎發病機制與牙周炎相似，因此齦溝液中miR有可能成為種植體周圍炎診斷、病情監測的生物學指標。有研究發現，牙周炎牙周組織中miR-23a表達明顯高于正常牙周組織，提示其可能參與牙周炎的發生[4]。此外，miR-146a廣泛參與炎癥反應，研究顯示miR-146a在牙齦炎組織中呈上調表達，提示其可能與牙周組織炎癥發生有關[5]。目前miR-23a與miR-146a在種植體牙周炎中的作用尚不明確。本研究通過對比種植體周圍炎、健康者齦溝液中miR-23a與miR-146a表達的差異，探究其與種植體周圍炎發生、病情程度的關系，試圖為種植體周圍炎診斷提供新的方向。

資料與方法

1 一般資料 選取2018年3月至2019年5月在本院口腔科治療的56例種植體周圍炎患者作為研究對象，其中男32例，女24例，年齡在28～64歲，平均年齡為(48.39±8.04)歲。另選取同期在本院體檢的47例健康者作為對照組，男25例，女22例，年齡在29～66歲，平均年齡為(49.05±8.67)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。病例納入標準：①種植體周圍炎患者經探診后發現出血，或伴有化膿；②種植體周袋深度超過5 mm；③首次接受種植體或牙周相關疾病治療；④無干擾咬合等因素；⑤受試者均知情同意，并簽訂知情同意書。排除標準：①有吸煙史；②近期服用抗生素、抗氧化劑、非甾體抗炎藥物等；③伴全身系統疾病者，如類風濕關節炎、支氣管炎、糖尿病、腫瘤等；④近期服用避孕藥、妊娠期或哺乳期婦女；⑤肝腎器官嚴重受損者。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

2 研究方法

2.1 齦溝液收集：將受檢牙牙齦上菌斑清除，采用清水漱口后用消毒棉球擦拭，再用氣槍吹干牙面，將濾紙沿牙齒輕柔插進牙齦溝中，遇阻力時暫停1 min，每顆牙齒均采集兩個位點，為正中頰側及正中舌側。采用游標卡尺記錄位點浸潤長度后，將干燥部位剪去，放置在500 μl PBS緩沖液中低溫3000 r/min離心后保留上清液，于-80℃保存。

2.2 牙周臨床指標檢測：對牙齒正中舌緣、正中唇緣厚度進行測量并記錄，參照文獻[6]對菌斑指數(Plaque index，PLI)進行評定，評分為0～3分。探針沿種植體周牙長軸方向檢測，壓力控制在0.5 N左右，記錄齦緣到牙周袋底或齦溝底距離，即探診深度(Pocket depth,PD);記錄牙周袋底到釉牙骨質界的距離，即附著水平(Clinical attachment level，CAL)；參照文獻[7]對齦溝出血指數(Sulcus bleeding index，SBI)進行評定，評分為0～5分。

2.3 實時定量PCR分析齦溝液中miR-23a、miR-146a水平：采用mirVana PARIS試劑盒(美國Ambion公司，批號AM1556)提取齦溝液上清總RNA，檢測純度及濃度后采用反轉錄試劑盒(美國Fermentas公司，批號K1622 )將RNA反轉錄為cDNA。miR-23a上游引物為5’-GGGGATCACATTGCCAGG-3’，下游引物為5’-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’；miR-146a上游引物為5’-CACTCCAGCTGGGIGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3’,下

游引物為5’-TGGTGTCGIGGAGTCG-3’；U6上游引物為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物為5’-CGCTICACGAATTTGCGTGTCAT-3’。采用qPCR反應試劑盒(德國 QIAGEN，批號330504)配制20 μl反應體系：2 μl cDNA模板，10 μl SYBR Green premix，0.6 μl上游、下游引物，6.8 μl ddH2O。采用PCR儀器(美國Bio-Rad公司C1000 Touch PCR儀)進行擴增反應，擴增程序：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火45 s，共40個循環。以U6 作為內參采用2-ΔΔCT法定量分析miR-23a、miR-146a 相對表達量。

2.4 Elisa法檢測齦溝液中IL-1β、TNF-α、IL-6水平：參考IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號依次為H002、H052、H007)說明書進行操作，設置空白孔(只加TMB溶液和終止液)和待測樣品孔。分別將100 μl樣品或不同濃度標準品加入待測樣品孔中，封膜后室溫孵育2 h。洗板5次后拍干，加入100 μl TNF-α、IL-1β、IL-6抗體，封膜后室溫孵育1 h。樣品孔內加入100 μl HRP標記抗體，封膜后避光孵育20 min，添加TMB溶液100 μl，封膜后避光孵育20 min行顯色反應，最后每孔均加入50 μl 終止反應液,采用酶標儀(EL10A8型全自動酶標測量儀，BIOBASE公司)測量波長為450 nm處OD值，繪制標準曲線并根據OD值計算因子濃度。

結 果

1 兩組患者齦溝液中miR-23a、miR-146a表達比較 與對照組相比，種植體周圍炎組齦溝液中miR-23a、miR-146a表達均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1兩組齦溝液中miR-23a、miR-146a表達對比

2 兩組齦溝液中炎癥因子水平比較 與對照組相比，種植體周圍炎組齦溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

3 兩組牙周癥狀比較 與對照組相比，種植體周圍炎組患者PD、CAL、PLI、SBI均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2齦溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

4 miR-23a、miR-146a與患者臨床指標的相關性分析 miR-23a與TNF-α、IL-1β、IL-6、PD、CAL、PLI、SBI均呈正相關(r=0.326，r=0.314，r=0.307，r=0.314，r=0.284，r=0.347，r=0.369，均P<0.05)；miR-146a與TNF-α、IL-1β、IL-6、PD、CAL、PLI、SBI均呈正相關(r=0.406，r=0.479，r=0.384，r=0.336，r=0.348，r=0.502，r=0.461，均P<0.05)。見圖1、圖2。

表3兩組受試者PD、CAL、PLI、SBI比較

圖1 miR-23a與患者臨床指標的相關性

圖2 miR-146a與患者臨床指標的相關性

5 Logistic回歸分析種植體周圍炎的危險因素 將影響種植體周圍炎發生的臨床因素性別、年齡、TNF-α、IL-1β、IL-6、PD、CAL、PLI、SBI、miR-23a、miR-146a等納入Logistic多因素回歸分析，結果顯示IL-6、PD、CAL、PLI、miR-23a、miR-146a均為影響種植體周圍炎發生的獨立危險因素，見表4。

表4Logistic分析種植體周圍炎的危險因素

6 miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎發生中的診斷價值 ROC分析顯示，miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎均具有一定的區分能力。miR-23a的AUC為0.835(95%CI：0.762～0.914)，靈敏度為73.91%，特異度為78.56%。miR-146a的AUC為0.865(95%CI：0.783～0.956)，靈敏度為78.56%，特異度為73.15%。見圖3。

圖3 血清miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎診斷的ROC曲線

討 論

miRNA是一類長度為22～25個核苷酸的非編碼RNA，能在轉錄后調控靶基因表達，從而參與細胞增殖、分化等生命活動。研究發現，多種miRNA參與牙周疾病的發生。例如，miR-142-3p、miR-144-5p上調和miR-218下調均與牙周炎的發生密切相關[8-9]；miR-27a過表達能夠促使新骨形成和再融合，對種植體周圍炎有一定的治療作用[10]。這些研究均表明miRNA參與牙周組織炎癥的發生，因此探究miRNA表達對種植體周圍炎的診斷以及預后預測具有重要的臨床意義。

miR-23a屬于miR-23變異體之一。過往研究發現，miR-23a可通過調控Foxp3乙酰化而誘導調節性T細胞功能缺陷[11]。Hetta等發現，miR-21和miR-23a在非小細胞肺癌組織表達下調，可能起致癌作用，且與患者不良預后有關[12]。Yachi等發現，miR-23a通過HOXD10促進膠質母細胞瘤的侵襲[13]。miR-23a與多種疾病的發生有關，在成骨細胞轉化中也發揮重要作用。Godfrey等發現miR-23a通過負向調控HOXA5、HOXA10和HOXA11蛋白表達參與骨細胞的發育和分化[14]。Zhang等發現miR-23a通過靶向骨形態發生蛋白信號傳導抑制牙周間充質干細胞的成骨，進而參與牙周炎的發生，以此推測miR-23a可能也與種植體周圍炎的發生相關[15]。本研究發現，種植體周圍炎患者齦溝液中miR-23a水平均顯著升高，提示miR-23a上調可能參與種植體周圍炎的發生。本研究進一步分析發現，齦溝液中miR-23a水平與齦溝液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，以及牙周臨床指標PD、CAL、PLI、SBI均呈正相關，表明隨著種植體周圍炎炎癥反應和病情的加重，患者miR-23a水平升高，提示miR-23a參與種植體牙周炎的發生、發展進程。

miR-146a屬于miR-146家族成員之一，在天然免疫及固有免疫中發揮重要的調控作用。研究發現，miR-146a在慢性風濕性關節炎患者中表達顯著升高，可通過抑制Th1細胞分化達到控制慢性炎癥反應的目的[16]。生物信息學檢測發現，風濕性關節炎成骨細胞中miR-146a表達差異較顯著[17]。Zhang等發現，miR-146a通過調節Bcl2抑制小鼠成骨細胞MC3T3-e1的增殖并誘導其凋亡[18]。Tang等發現，miR-146a通過TRAF6/p38途徑負性調節人牙周膜成纖維細胞對牙齦卟啉單胞菌的炎癥反應，提示miR-146a參與牙周炎的發生[19]，然而與種植體牙周炎的關系目前尚不清楚。本研究對比健康者、種植體牙周炎患者齦溝液中miR-146a的表達水平，發現種植體牙周炎患者齦溝液miR-146a表達明顯高于健康者，提示miR-146a可能與種植體周圍炎的發生相關。Ghotloo等發現，miR-146a與牙周炎疾病嚴重程度有關，隨著病情程度的增加，其水平逐漸升高[20]。與此相似，本研究發現齦溝液中miR-146a水平與齦溝液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，以及牙周臨床指標PD、CAL、PLI、SBI均呈顯著正相關，表明隨著種植體周圍炎炎癥反應和病情的加重，患者miR-146a水平升高，提示miR-146a參與種植體牙周炎的發生、發展進程。

miRNA在種植體周圍炎齦溝液中的異常表達有可能成為種植體周圍炎診斷及治療的突破點。本研究假設miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎患者齦溝液中的失調可能對種植體周圍炎具有潛在的診斷價值。采用ROC曲線分析miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎的診斷價值發現，齦溝液中miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎均具有一定的區分能力，miR-23a診斷種植體周圍炎的AUC為0.835，靈敏度為73.91%，特異度為78.56%；miR-146a的AUC為0.865，靈敏度為78.56%，特異度為73.15%。Logistic回歸分析發現，miR-23a、miR-146a是影響種植體周圍炎發生的危險因素。這些結果提示，齦溝液中miR-23a、miR-146a與種植體周圍炎的發生相關，可能是種植體周圍炎潛在的診斷標志物。

綜上所述，種植體周圍炎齦溝液中miR-23a、miR-146a表達上調與患者炎癥反應、病情程度相關，可能為種植體周圍炎的潛在診斷標志物，且是影響種植體周圍炎的危險因子。本研究僅評估了miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎中的臨床意義，并未對其具體機制進行研究，有待后續完善研究方案深入探究。