聲脈沖輻射力成像定量評估兔肝缺血再灌注損傷實驗研究*

王雙龍，于 美，呂 鑌，劉翔宇，李 龍，鄭 露，董 磊

1.山東省濟寧市第一人民醫院(濟寧272011)；2.濟寧醫學院附屬醫院超聲科(濟寧272011)；3.解放軍聯勤保障部隊第九六零醫院超聲科(濟南250031)

肝缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)是指肝缺血一定時間并恢復血流灌注后，肝組織損傷不但沒有恢復，反而進一步加重的現象[1]。肝IRI常發生于外科手術如肝葉切除、肝移植，其它臨床疾病如休克、創傷、敗血癥等。本研究探討應用聲脈沖輻射力成像(Acoustic radiation force impulse imaging,ARFI)技術觀察肝缺血再灌注損傷動態變化的可行性，以期為臨床提供診療依據。

材料與方法

1 實驗動物與分組 實驗動物：新西蘭大白兔共60只，質量2.3～3 kg，雌雄不限，購自濟南西嶺角養殖繁育中心[SCXK(魯)2010-0005]，在濟南軍區總醫院實驗動物中心普通級飼養間飼養[SYXK(軍)2007-026]。實驗分組：60只新西蘭大白兔，因麻醉、術中出血過多及未到設定再灌注時間點意外死亡4只；其余56只分為假手術組(Sham組)及缺血再灌注組(0.5、2、6、12、24、72 h)7個亞組，每組8只。

2 主要實驗儀器 Siemens Acuson S2000超聲診斷儀，配備有聲輻射力脈沖功能軟件，選擇14L線陣探頭，頻率為14 MHz(西門子醫療，德國)。無創動脈夾(張家港市青松生物醫學儀器有限公司，中國)。紫外微量分光光度計(Amersham Pharmacia Biotech公司，美國)。7600大型全自動生化儀(日立公司，日本)。奧林巴斯雙目顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)。

3 主要試劑 鹽酸氯胺酮注射液 (上海第一生化藥業有限公司)。陸眠寧Ⅱ注射液(吉林省華牧動物保健品有限公司)。

4 實驗方法

4.1 實驗動物模型建立：參照Taha等[2]的方法建立兔肝部分缺血再灌注模型，具體步驟如下：上腹部正中切口，暴露肝門部，分離出肝十二指腸韌帶并向上分出肝左、右葉的管道結構，用無創動脈夾夾閉肝左葉的肝動脈、門靜脈及膽管，用0.9%生理鹽水溶液浸泡的無菌紗布覆蓋腹部正中切口，超聲造影確定肝左葉完全夾閉，無血流進入,右葉正常灌注；60 min后打開無創動脈夾恢復肝左葉的血供，關閉腹腔。假手術組(Sham組)操作方法同上，但不用無創動脈夾夾閉肝左葉的肝動脈、門靜脈及膽管。

4.2 ARFI檢查方法：各組兔經肌肉注射鹽酸氯胺酮和陸眠寧Ⅱ 0.2 ml/kg給予麻醉，仰臥位固定在試驗臺上，采用Siemens Acuson S2000超聲診斷儀，首先用14L線陣探頭觀察兔肝，顯示肝左葉及腹主動脈切面(圖1)，ARFI模式下啟動聲觸診組織量化功能測量肝左葉的剪切波速度值(Shear wave velocity，SWV)，操作時盡可能使聲束方向垂直于肝表面,盡量避開大血管，在不對肝組織施加壓力下，點擊激發鍵，所測組織SWV將顯示在屏幕右側,每個部位至少測量3次,所得結果取平均值。本研究檢查深度設定為1.5 cm，取樣框大小設定為1.0 cm×1.2 cm。

圖1 ARFI技術測量肝左葉SWV

5 檢測項目與方法 光鏡組織學評分參照Nurdan Bedirli[3]基于5個參數的半定量方法作為評分標準，在顯微鏡下觀察病理組織切片，按表1的方法對每只兔子做半定量評分，5個參數的分值總和即為該兔子的光鏡組織學評分。

表1肝IRI光鏡組織學評分標準

結 果

1 Sham組及肝IRI各組SWV值比較 肝IRI非梗死組織及梗死組織的各組SWV值均較Sham組升高，差異均有統計學意義(P<0.001),見表2,圖2。

表2Sham組及肝IRI各組SWV值比較

注：與Sham組比較,*P<0.001

2 肝IRI非梗死組織與梗死組織SWV值比較 肝IRI 6、12、24、72 h組梗死組織SWV值均較非梗死組織顯著升高，差異有統計學意義(P<0.001)；肝IRI 非梗死組織12 h達到峰值，而梗死組織24 h達到峰值，見表3。

3 病理學檢查結果 肝IRI 6、12、24、72 h組中所有實驗兔肝臟邊緣均出現梗死區，病理結果顯示梗死區肝細胞核固縮紅染或消失，呈凝固性壞死，非梗死區肝小葉結構紊亂，肝細胞索竇排列不規則，肝竇內可見中性粒細胞聚集(圖3)。光鏡組織學評分：各組間肝組織光鏡組織學評分差異均有統計學意義(P<0.001)；各組評分與Sham組相比均升高；評分在0.5h組到24 h組顯著上升，24 h達高峰后緩慢下降，直至72 h仍高于Sham組(圖4)。

圖2 Sham組及肝IRI各組SWV值(檢查深度為1.5 cm)

表3梗死組織與非梗死組織SWV值比較

注：與非梗死組織比較*P<0.001

圖3 病理學檢查結果(HE染色，×200)

4 肝IRI各組SWV與光鏡組織學評分相關性分析 非梗死組織及梗死組織的SWV與光鏡組織學評分均具有顯著相關性(r=0.759，P<0.01；r=0.774，P<0.01)；其中6 h梗死組織出現以后，梗死組織的SWV與光鏡組織學評分相關性(r=0.774，P<0.01)較非梗死組織好(r=0.473，P<0.01)。

圖4 肝IRI各組光鏡下組織學評分變化情況

討 論

肝IRI發生于因各種因素導致肝缺血再次恢復血供時，臨床上常見于肝外科手術、心力衰竭及缺血性休克等，當缺血時間過長不能及時診斷及治療時，肝臟的血流再灌注能夠損傷肝細胞，嚴重的肝IRI可引起其他器官功能衰竭，導致病情加重、手術失敗，甚至患者死亡等[4]。

聲輻射力脈沖成像(ARFI)是一種測量組織硬度的新技術，包括用于定性分析的聲觸診組織成像(Virtual touch tissue imaging,VTI)和用于定量分析的聲觸診組織成像定量分析(Virtual touch tissue quantification,VTQ)。該技術通過向感興趣區組織內發射脈沖,組織由于受到脈沖作用而產生縱向及橫向的形變，收集縱向形變的信息實現組織成像即為VTI，收集橫向形變信息，通過測量其產生的SWV值反映組織硬度即為VTQ，感興趣區組織越硬，SWV值越大[5]。

目前ARFI技術已廣泛應用于評估肝臟彌漫性病變的研究，涂春華等[6]將臨床確診的322例慢性病毒性肝病患者分為慢性肝炎組和早期肝硬化組(Chnd-Pugh A級)，所有患者均行FibroScan及ARFI檢查，用FibroScan測量肝硬度值(Liver stiffness measurement,LSM)、ARFI測量VTQ值，結果表明早期肝硬化組肝臟VTQ值高于慢性肝炎組患者，肝臟VTQ值對早期肝硬化的受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.821，最佳診斷界值為1.465，研究表明早期肝硬化的診斷價值高于FibroScan技術。高明茹等[7]對121 例慢性乙型肝炎患者分別進行ARFI檢查及肝臟穿刺活檢，以肝臟穿刺活檢肝纖維化病理結果為“金標準”，采用受試者工作特征曲線(ROC)分析ARFI技術對CHB 肝纖維化分期的準確性，結果表明，ARFI技術與肝纖維化分期具有較好的正相關性。魏華等[8]測量227例2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者的肝實質VTQ值，分析T2DM合并NAFLD患者肝實質 VTQ值與脂肪肝嚴重度的相關性，結果表明重度脂肪肝VTQ值顯著高于輕、中度，肝實質VTQ值與脂肪肝程度呈直線正相關。肝IRI是一種肝彌漫性病變，再灌注不同時間段有著其典型的病理改變，本研究即探討應用ARFI技術評估肝IRI的可行性。

本研究利用ARFI技術測量肝缺血60 min不同再灌注時間點的SWV值，發現再灌注不同時間點的SWV值均較Sham組升高,說明肝IRI可導致肝組織變硬，這與其病理改變相一致。肝IRI的病理改變主要是肝細胞水腫，肝細胞壞死，肝竇、匯管區淤血，中性粒細胞浸潤，血管內皮細胞損傷和微血管內血栓形成等[9]。缺血導致肝細胞的供氧不足，并導致ATP含量減少，ATP含量減少使得跨膜運輸離子的Na-K泵受到抑制，導致細胞內外鈣離子重新分布，繼發細胞內鈣離子聚集，最終導致細胞腫脹及死亡[10]。肝細胞水腫導致肝臟體積增加，肝包膜張力增大，彈性下降，肝臟質地變硬。肝細胞點狀壞死主要表現為胞漿濃縮，細胞核的固縮，肝網狀纖維結構的塌陷，這會導致感興趣區肝組織彈性下降[11]。

肝IRI加重考慮繼發于血管收縮、血管內皮細胞腫脹、炎性細胞黏附導致的血管管腔狹窄，進而導致微循環障礙[9]。本研究發現，再灌注6 h組在兔肝組織邊緣即可出現缺血梗死區，12～24 h缺血梗死區不斷擴大。肝臟接受肝動脈、門靜脈的雙重血供，肝動脈交通支豐富，門靜脈是優勢血供，故臨床上肝梗死較少見[12]，但本研究將肝動脈、門靜脈同時夾閉時間達60 min，同時由于肝IRI的“無復流現象”的發生，每只實驗兔肝臟邊緣均出現梗死灶。本研究結果表明梗死區較非梗死區SWV值明顯升高，兩者間差異有統計學意義，說明ARFI技術能夠準確地定性、定位梗死灶，為臨床治療提供有力依據。

非梗死區SWV值在2 h組明顯升高，之后緩慢升高，至12 h達到峰值之后逐漸下降，通過分析結果，非梗死區SWV值與肝組織學評分具有顯著相關性，說明非梗死區SWV值能夠反映肝IRI的病理學改變。但本研究表明SWV值在12 h組達到峰值，而組織學評分在24 h組達到峰值，我們認為是由于肝組織學評分是判斷肝組織的綜合性表現，本研究的造模為了使再灌注各時期的病理改變較為典型，缺血損傷較重，梗死區的出現使得形態學積分普遍較高，而SWV值是判斷非梗死區內感興趣區內的硬度。由此也說明SWV值具有一定的局部定位功能，即可通過判斷感興趣區內肝組織的硬度來定位特定的病理學改變。

梗死區SWV值在6～24 h呈升高趨勢，72 h組較24 h組降低，統計結果分析表明SWV值與病理組織學評分有顯著相關性，且兩者均在24 h達到峰值，具有一致性。因此，ARFI技術可用于肝梗死區的定性、定位診斷，但是否可在6 h以前就可早期診斷將是下一步研究的重點。

綜上所述，SWV值的變化能夠反映病理學改變；梗死區出現以前，非梗死區SWV值與病理組織學評分有較好一致性;梗死區出現以后，SWV值可用于梗死區的定性、定位，梗死區SWV值與病理組織學評分有較好一致性。總之，ARFI技術是評估肝IRI程度的一種快速、便捷、實時、較準確的影像學檢查方法。