高通量測序技術在先天性上瞼下垂家系致病基因檢測中的應用價值*

車選義,楊 燕,劉曉梅,李 迪

陜西省人民醫院(西安醫學院附屬醫院)(西安710068)

先天性上瞼下垂屬于常染色體顯性疾病，嬰兒出生時上瞼就無法正常抬起。此病病因為基因突變致使提上瞼肌分化不完全，導致上瞼發生不同程度的無法抬起,輕者可稍微抬起上瞼，遮住部分瞳孔，嚴重者上瞼完全無法抬起，僅靠額肌通過代償性收縮來維持較窄的瞼裂[1]。目前國際上一致認為該病的致病基因為FOXL2基因。迄今為止，已在全球患者中檢測到200多種FOXL2基因突變[2]。本文通過高通量測序技術對一個先天性上瞼下垂家系及100例正常對照者進行FOXL2基因突變檢測，現報告如下。

對象與方法

1 研究對象 先證者，女，17歲，學生，漢族。患先天性上瞼下垂。視力：左眼1.0，右眼1.0；色覺正常。眼部檢查：雙眼反向內眥贅皮，瞼裂長度為左眼22 mm、右眼21 mm。壓迫眉弓時，囑患者平視，右眼瞼裂寬度為4 mm，左眼瞼裂寬度為4 mm，兩眼內眥距離40 mm，角膜橫徑12 mm，垂直徑11 mm。充分睜開時，右眼瞼裂寬度為6 mm，左眼瞼裂寬度為6 mm 。無眼球運動障礙。全身其它生理狀況正常。家系調查：家系中無近親通婚，由先證者向上追溯調查，該家系4代中共有12例患先天性上瞼下垂者，家系圖譜見圖1。該家系中先證者為Ⅳ3。最先出現先天性上瞼下垂的是Ⅰ1，其子女Ⅱ2、Ⅱ4、Ⅱ6、Ⅱ8均為患者。Ⅱ2婚后無生育；Ⅱ4生有三男兩女，其中男Ⅲ3，女Ⅲ5為患者；Ⅱ6生有一男兩女，其子Ⅲ8為患者；Ⅱ8生有兩女Ⅲ10、Ⅲ11均為患者。第四代中Ⅳ1、Ⅳ3均為患者。連續四代均有發病，以垂直方式連續傳遞，男女患者均有且患病率相等，符合常染色體顯性遺傳。本組先證者及其家屬共26例，另選取100例正常體檢者為對照組(來自陜西省人民醫院職工健康查體者，均為漢族)。本研究經過醫院倫理委員會批準，同時所有研究對象均知情同意。

圖1 先天性上瞼下垂家系圖譜

2 研究方法

2.1 獲取樣本及提取DNA：采用TIANENE TIANamp Genomic DNA Kit提取先證者及其家屬與100例正常對照者的外周血及外周血細胞基因組DNA，按說明書進行操作[3]。

2.2 研究對象FOXL2基因高通量測序檢測：高通量測序操作流程與目標捕獲測序標準流程相同。使用美國Covaris公司生產的S2超聲儀對3 μg基因組DNA進行片段化，對所得產物進行末端修復后，用美國Beckman公司生產的Ampure Beads磁珠對片段進行純化。在末端修復酶與末端修復緩沖液的作用下，純化片段的3’尾端加入多聚A，形成特殊懸垂結構，再次對產物純化后，將特殊序列標簽連接到純化產物上，再次對其純化[4]。通過PCR技術對產物進行擴增。擴增區域為FOXL2基因的外顯子及附近的拼接位點。PCR反應體系如下：引物1引物2各1 μl,DNA模板30 μl,熱啟動酶1 μl,10 mmol/L dNTP 2 μl,5×Buffeer 20 μl,ddH2O 40 μl,DMSO 5 μl。PCR反應條件為：首先98 ℃ 1min；然后以98℃ 20 s，65℃ 30 s,72℃ 30 s為一次循環，進行9次循環；9次循環完成后,72 ℃ 延伸5 min[5]。采用美國Beckman公司生產的Ampure Beads磁珠對PCR擴增的產物進行純化，構建研究對象的DNA文庫。用Nanodrop 2000分光光度計對所構建的DNA文庫進行定量測量，并使用美國Illumina公司出產的Illumina HiSeq 2000高通量測序儀對其進行測序[6]。具體操作見說明書。

2.3 高通量測序數據分析：采用Illumina HiSeq 2000高通量測序儀的配套軟件Trim-Galore程序去掉3’/5’通用引物序列及低質量序列，保留片段長度>80 bp及測序質量>Q20的序列[7]。通過BWA程序實現有效序列與人類基因組序列間的比對，并用GATK軟件分析堿基位點的變異。通過對比選出突變基因[7]。

2.4 Sanger測序：按照Sanger測序標準流程對先證者及家系成員與100例正常對照者針對FOXL2基因進行基因分析。引物采用Crisponi 等報道的4對引物，由上海生工生物工程有限公司進行合成，測序引物序列、退火溫度及擴增序列長度見表1。選擇其中一對引物進行PCR擴增[8]。PCR反應體系為：上下游引物各1 ml,DNA模板1 μl,10×Taq Buffer 5 μl,10 mmol/L dNTP 1 ml,5 U Taq酶0.5 μl,ddH2O 35 μl,25 mmol/L MgCl25 μl。PCR反應條件：首先95 ℃3 min；然后以95 ℃ 30s,57 ℃ 30s,72 ℃ 30s為一個循環,循環35次；最后72℃延伸5 min[9]。所得PCR擴增產物經過純化后，委托上海生工生物工程有限公司對其進行測序。將所得的測序結果與NEBI標準序列進行比對。

表1FOXL2 基因編碼區引物序列、擴增片段長度及退火溫度

3 觀察指標 通過高通量測序技術對研究對象DNA序列進行測序，并通過相關軟件與人類基因組數據庫或dbSNP等數據庫進行比對，找出突變位點，通過Sanger測序對高度可疑的位點進行測序，并將所得的測序結果與NEBI標準序列進行比對。最終確定突變位點。

結 果

1 研究對象一般資料 先證者及其家屬共26例，男13例(占50%)，女13例(占50%)，年齡7～67歲，平均年齡(34.8±13.5)歲；正常對照組100例，男50例(占50%)，女50例(占50%)，年齡21～65歲，平均年齡(42.8±16.6)歲，先證者及其家屬與正常對照者一般資料(年齡、性別、種族)比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 FOXL2基因c.578位點基因型檢測結果 采用Sanger測序法對先證者的高通量測序結果進行驗證，驗證發現先證者先天性上瞼下垂致病基因FOXL2基因的外顯子區存在c.578A>G錯義突變。對患者家系成員及100例正常對照者的FOXL2基因c.578位進行基因檢測，發現表現型異常的Ⅱ8、Ⅲ10、Ⅲ11、Ⅳ3 的FOXL2基因均存在c.578A>G錯義突變，但表現型正常的Ⅱ7、Ⅳ9、Ⅳ4及100例正常對照者的FOXL2基因均未發生c.578位點錯義突變，為野生型。患者家系成員及100例正常對照者FOXL2基因c.578位點基因型，見表 2。

表2家系成員及100例正常對照者FOXL2 基因c.578位點基因型

討 論

該先天性上瞼下垂患者屬于瞼裂狹小-上瞼下垂-反向內眥贅皮綜合征，是由于基因位點的錯義突變導致蛋白質突變，使提上瞼肌發育不完全導致。該病的全球發病率為1︰50000， 是一種十分罕見的先天性常染體顯性遺傳性疾病[10]。1841年Von Ammon最先報道該疾病，1912年Komoto對該疾病進行了詳細的描述。該病的臨床表現主要在眼部比較典型，表現為上瞼下垂、瞼裂狹小、內眥間距增寬、反向內眥贅皮等特征，又稱為眼瞼四聯癥[11]。該病不僅影響患者的外觀形象，給患者帶來心理障礙，有些病例還伴有其他系統的異常發育，如鼻梁低平、智力低下、發育遲緩、小頭畸形先天性室間隔或房間隔缺損等。

該疾病的致病基因為FOXL2基因。FOXL2 基因屬于細胞核內winged-helix/forkhead轉錄因子家族，位于3號染色體的3q23區域，僅有一個外顯子，編碼區長度為2.7 kb，共編碼37個氨基酸。該基因的編碼區有兩個特征性結構：編碼蛋白位點為221～234的Poly-Ala 串與位于其上游的編碼蛋白位點為52～152的 DNA 結合 Forkhead 結構域。DNA 結合 Forkhead結構域由3 個β折疊、2 個翼狀結構及3 個α螺旋組成，共含有100 個氨基酸。翼狀結構可使DNA結合區與靶基因 DNA 雙螺旋小溝結合；通過α螺旋，DNA結合區可識別靶基因 DNA 雙螺旋大溝上的堿基序列并與其發生相互作用[12]。

本研究利用高通量測序技術對已知的與先天性上瞼下垂相關的FOXL2基因進行檢測，發現先證者的FOXL2基因發生了c.578A>G錯義突變，通過Sanger測序法對高通量測序結果進行驗證，兩測序方法的測序結果一致。利用Sanger測序法檢測家系成員及100例正常對照者的FOXL2基因c.578位點，發現該家系所有患者均攜帶FOXL2基因c.578A>G錯義突變，但家系中表型正常者及100例正常對照者的FOXL2基因c.578均為野生型，未發現突變。FOXL2基因c.578A>G錯義突變導致密碼子由 AAG 突變為 AGG,第193位的賴氨酸突變為精氨酸，最終導致疾病。因此該家系患者在生育時應到相關部門進行產前診斷。

不同于傳統的Sanger測序法，高通量測序采用的邊合成邊測序的基本原理，通過構建測序基因文庫，可一次性對多個目標基因進行基因序列分析[13]，最多可檢測400萬條序列，閱讀14G的堿基數，具有成本低、通量大、時間短等優勢，是目前應用較多的高效篩選致病基因的主要方法之一。目前，該技術在罕見疾病、腫瘤及心血管疾病的研究中應用較為廣泛[14-16]。本研究采用高通量測序技術對先天性上瞼下垂相關致病基因FOXL2基因進行測序，檢測出該基因發生c.578A>G錯義突變，為該疾病家系提供了有效的再生育指導及遺傳咨詢，避免了子代該疾病的發生，從而達到優生優育的目的。

綜上所述，該家系的致病基因為FOXL2基因發生c.578A>G錯義突變，高通量測序技術可用于先天性上瞼下垂基因突變的快速檢測，對先天性上瞼下垂的產前診斷和遺傳咨詢有一定意義。