中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）類圍食膜蛋白基因克隆及其在WSSV感染中的表達(dá)

張廣成，尹文娟，劉 芳，何孟宇，孟凡娟，王麗燕

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

圍食膜（peritrophic membrane，PM）是在無脊椎動(dòng)物腸道內(nèi)攝入食物的一層半通透性膜狀結(jié)構(gòu)[1]，主要由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)構(gòu)成[2-4].其功能類似于脊椎動(dòng)物消化道的黏液層，具有保護(hù)中腸上皮細(xì)胞免受食物顆粒機(jī)械損傷、阻擋病原菌接觸上皮細(xì)胞造成感染、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等作用[5-7].圍食膜蛋白（peritrophin）是構(gòu)成圍食膜結(jié)構(gòu)的主要蛋白成分，具有一個(gè)或多個(gè)保守的幾丁質(zhì)Ⅱ型結(jié)合結(jié)構(gòu)域（chitin-bindingdomain2，ChtBD2），也稱為Peritrophin-A 結(jié)構(gòu)域.圍食膜蛋白最先是從昆蟲的PM 中解離得到，研究發(fā)現(xiàn)圍食膜蛋白在輔助消化食物和防控外源微生物對(duì)昆蟲侵染中都發(fā)揮了巨大作用[4，8].近年來研究發(fā)現(xiàn)，蝦類也具有同昆蟲類似的圍食膜結(jié)構(gòu)[9-10]，它在免疫防病中的功能有待深入研究.

對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)是世界性海洋生物資源的重要支柱產(chǎn)業(yè)，近年來病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.在眾多細(xì)菌與病毒引起的病害中，由對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）引起的病毒病較為嚴(yán)重.自然養(yǎng)殖條件下，WSSV 病毒病的傳播主要是由對(duì)蝦殘食染病對(duì)蝦或尸體引起，因此，消化道是病毒感染的主要位點(diǎn).WSSV 病毒分子檢測(cè)結(jié)果同樣證實(shí)，腸道是感染W(wǎng)SSV 過程中最早可檢測(cè)到其核酸的組織之一[11-13].

本文通過基因克隆技術(shù)獲得了中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）的類圍食膜蛋白基因FcPT2，研究其在不同組織中的表達(dá)及其應(yīng)對(duì)WSSV 感染的表達(dá)變化，進(jìn)而探究類圍食膜蛋白FcPT2 在對(duì)蝦抗WSSV 感染中發(fā)揮的作用.研究結(jié)果將為深入開展對(duì)蝦WSSV 病毒性疾病的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用中國(guó)明對(duì)蝦由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供.對(duì)蝦體長(zhǎng)8 cm 左右，在23 ℃條件下，養(yǎng)殖于充氣自然海水中，每天喂食3 次，每次喂食5 g 蝦飼料.

Unizol 試劑，上海博星基因芯片責(zé)任有限公司；MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RQ1 RNase-free DNase 和 nuclease-free water，美國(guó) Promega 公司；DNA 回收試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；PMD-19-T 和 DH5α，天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Master Mix，美國(guó)Applied Biosystems 公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣品制備及WSSV 感染

對(duì)實(shí)驗(yàn)用中國(guó)明對(duì)蝦進(jìn)行隨機(jī)WSSV 檢測(cè).取對(duì)蝦部分鰓組織搗碎，加入90 μL 濃度為50 mmol/L 的NaOH 溶液，煮10 min 后離心取上清液.根據(jù)WSSV囊膜蛋白VP28 基因序列設(shè)計(jì)引物VP28F 和VP28R，如表1 所示，進(jìn)行一步法PCR 檢測(cè).用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將結(jié)果為陰性的樣本作為無WSSV 感染的對(duì)照組.分別取5 只無WSSV 感染的對(duì)蝦各個(gè)組織，包括肝胰臟、神經(jīng)、心臟、鰓、中腸、精巢、卵巢、血細(xì)胞、眼柄、胃、淋巴Oka、肌肉，分別保存于液氮中，進(jìn)行后續(xù)RNA 提取、基因克隆和定量PCR 實(shí)驗(yàn).

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列信息Tab.1 Primer sequences used in this study

參照文獻(xiàn)[10，14]中的方法準(zhǔn)備和提取WSSV.提取的WSSV 拷貝數(shù)用PBS 稀釋為80 copies/μL，每只蝦注射10 μL.注射感染病毒36 h 后，分離提取對(duì)蝦的消化道組織作為WSSV 感染組，進(jìn)行RNA 提取和Real-time PCR 實(shí)驗(yàn).

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成

利用Unizol 試劑提取中國(guó)明對(duì)蝦各組織的總RNA，方法參照使用說明書.提取的總RNA 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)RNA 完整性后，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量.反轉(zhuǎn)錄前利用RQ1 RNase-free DNase 降解總RNA 中污染的DNA.第一鏈cDNA 的合成按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行，以隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，用于實(shí)時(shí)定量PCR，-80 ℃冰箱保存其余的RNA.

1.2.3 序列分析

根據(jù)本課題組所建立的中國(guó)明對(duì)蝦腸道轉(zhuǎn)錄組信息和中國(guó)明對(duì)蝦WSSV 感染前后頭胸甲轉(zhuǎn)錄組信息，發(fā)現(xiàn)一條腸道類圍食膜蛋白FcPT2 在WSSV 感染前后存在表達(dá)差異，利用序列在線比對(duì)軟件BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast）分析比對(duì) FcPT2，利用在線SMART 軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析FcPT2 基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域特征，利用Clustal W軟件進(jìn)行多序列分析比對(duì).

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）

以FcPT2 序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR 引物RT-FcPT2-F和RT-FcPT2-R.中國(guó)明對(duì)蝦18S rRNA 作為對(duì)照基因，設(shè)計(jì)引物18S-F 和18S-R，如表1 所示.以合成的各組織cDNA 作為模板，不含RNase 的水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照.

實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)物為 25 μL 體系，包含：1UTakara Ex taq hot start、1× Ex taq buffer（plus Mg2+）、0.2 mmol/L的 dNTP、1× SYBR Green Master Mix、0.2 mmol/L 的正向引物、0.2 mmol/L 的反向引物、1 μL cDNA 模板.反應(yīng)程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性 2 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 15 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，40 個(gè)循環(huán).反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析，確定只有一條特異性的PCR 產(chǎn)物被擴(kuò)增.每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，每個(gè)樣品取自5 只對(duì)蝦.

利用SPSS 11.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)明對(duì)蝦類圍食膜蛋白序列分析

本課題組根據(jù)所得中國(guó)明對(duì)蝦腸道的轉(zhuǎn)錄組信息，獲得了FcPT2 的部分cDNA 序列，如圖1 所示.通過Smart 軟件在線分析得知，中國(guó)明對(duì)蝦FcPT2 編碼的蛋白含有3 個(gè)典型的ChtBD2 結(jié)構(gòu)域.通過NCBI Blast 軟件對(duì)所得基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行在線搜索，結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可以看出，F(xiàn)cPT2 與昆蟲的圍食膜蛋白 TcCPAP3-D2、ApCPAP3-D2 和 NvCPAP3-D2 具有較高相似性，分別為74%、74%和71%.

圖1 中國(guó)明對(duì)蝦FcPT2 部分cDNA 及其編碼的氨基酸序列和FcPT2 幾丁質(zhì)Ⅱ型結(jié)合結(jié)構(gòu)域Fig.1 Partial cDNA sequence and deduced amino acid sequence of FcPT2 gene and chitin-binding domain Ⅱof FcPT2 in F.chinensis

圖2 FCPT2 與其他昆蟲的CPAP3 氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence comparison of FcPT2 in F.chinensis with CPAP3 of other insects

對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦類圍食膜蛋白（FcPT2）與其他蝦和昆蟲類圍食膜蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，對(duì)蝦類的圍食膜蛋白（PT）首先聚在一起，然后與昆蟲圍食膜蛋白CPAP3 聚類.FcPT2 與CPAP3 圍食膜蛋白聚在一起，進(jìn)一步說明了FcPT2 與昆蟲CPAP3 圍食膜蛋白具有相對(duì)較高的序列相似性.

圖3 FcPT2 與其他圍食膜蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of FcPT2 with other peritrophins

2.2 中國(guó)明對(duì)蝦類圍食膜蛋白基因的表達(dá)特征

對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦不同部位的定量PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)cPT2 主要在眼柄（eyestalk）和胃（stomach）組織中進(jìn)行表達(dá)，鰓（gill）、精巢（testis）、卵巢（ovary）和血細(xì)胞（hemocyte）中也有少量表達(dá)，肝胰臟（hepatopancreas）、神經(jīng)（nerve）、心臟（heart）、淋巴 Oka 和肌肉（muscle）中較少甚至無表達(dá)，如圖4 所示.中國(guó)明對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV 后，F(xiàn)cPT2 在胃組織中出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，如圖5 所示，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量為對(duì)照組表達(dá)量的3.64 倍（P<0.05），這說明FcPT2 可能在中國(guó)明對(duì)蝦抗WSSV的侵染中發(fā)揮一定的作用.

圖4 FcPT2 在中國(guó)明對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of FcPT2 in different tissues in F.chinensis

圖5 WSSV 感染前后FcPT2 在中國(guó)明對(duì)蝦胃組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of FcPT2 in stomach of F.chinensis before and after WSSV infection

3 討論與結(jié)論

圍食膜蛋白最早是用強(qiáng)變性劑從昆蟲圍食膜中解離出來的，其典型特征是含有ChtBD2 結(jié)構(gòu)域[8，15].Jasrapuria 等[16]根據(jù)系統(tǒng)樹、表達(dá)和功能分析，將赤擬谷盜中含有ChtBD2 結(jié)構(gòu)域的蛋白分成3 個(gè)家族：PMP（peritrophic matrix proteins）、CPAP3（cuticular proteins analogous to peritophins 3）和 CPAP1（cuticular proteins analogous to peritophins 1）.PMP 家族屬于腸道特異性蛋白，又稱為圍食膜因子（peritrophin），是圍食膜結(jié)構(gòu)形成的主要蛋白成分，而CPAP3 和CPAP1 家族蛋白則只是表達(dá)于表皮形成相關(guān)組織中，其功能還未知.近年來研究發(fā)現(xiàn)，蝦類具有同昆蟲類似的圍食膜結(jié)構(gòu)，其圍食膜成分同樣是由幾丁質(zhì)和蛋白構(gòu)成[10].本文對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦類圍食膜蛋白FcPT2 的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cPT2 與昆蟲CPAP3 圍食膜蛋白有較高的相似性，其氨基酸序列中也具有典型的ChtBD2 結(jié)構(gòu)域，但是蛋白序列差異較大.在昆蟲中圍食膜蛋白的種類也不同，從幾種到幾十種[17-18].同種昆蟲中，發(fā)育時(shí)期、餌料營(yíng)養(yǎng)等也會(huì)影響圍食膜蛋白的種類.

FcPT2 的組織表達(dá)結(jié)果顯示，類圍食膜蛋白基因除了表達(dá)于腸道組織外，還廣泛存在于其他組織中.在短鉤對(duì)蝦（P．semisulcatus）[19]和日本對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）[20]卵巢中幾種類圍食膜蛋白基因呈組成型高表達(dá)，由此稱之為蝦卵巢圍食膜蛋白（shrimp ovarian peritrophins，SOPs）.在昆蟲圍食膜蛋白研究中，Barry等[21]和 Behr 等[22]從果蠅（Drosophila melanogaster）的表皮形成相關(guān)組織中鑒定到編碼ChtBD2 的基因；Nisole等[23]從云杉卷葉蛾（Choristoneura fumiferana）中克隆到一條cDNA，能夠編碼具有ChtBD2 結(jié)構(gòu)的存在于表皮中的蛋白.本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)cPT2 主要表達(dá)于中國(guó)明對(duì)蝦的眼柄和胃中，這2 個(gè)器官中都含有上皮，是與表皮形成相關(guān)的組織，該蛋白在鰓、精巢、卵巢和血細(xì)胞中也有少量表達(dá).由此可知，具有ChtBD2 結(jié)構(gòu)域的類圍食膜蛋白不僅存在于圍食膜中，在其他組織中也發(fā)揮了重要作用.

蝦類圍食膜蛋白呈現(xiàn)了多樣的生物學(xué)功能：如短鉤對(duì)蝦中存在2 條SOP，具有在受精卵表面形成保護(hù)層的功能[19]；墨吉對(duì)蝦的SOP 具有抗菌肽活性[24-25]；中國(guó)明對(duì)蝦類圍食膜蛋白PTPH 具有結(jié)合細(xì)菌和幾丁質(zhì)的活性[26]；凡納濱對(duì)蝦類圍食膜蛋白能夠與WSSV 的多種囊膜蛋白相互作用[27].Hui 等[28]發(fā)現(xiàn)日本對(duì)蝦的3種腸道類圍食膜蛋白基因在WSSV 感染后出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，據(jù)此提出這類圍食膜蛋白在腸道免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用.本研究結(jié)果顯示，WSSV 感染中國(guó)明對(duì)蝦后，F(xiàn)cPT2 在對(duì)蝦胃中的表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示該靶基因可能也在中國(guó)明對(duì)蝦應(yīng)答WSSV 感染過程中發(fā)揮作用.

綜上所述，本研究鑒定了中國(guó)明對(duì)蝦的類圍食膜蛋白基因FcPT2，F(xiàn)cPT2 蛋白主要表達(dá)于眼柄和胃中，其編碼的氨基酸序列不同于其他已報(bào)道的蝦類圍食膜蛋白，但與昆蟲CPAP3 圍食膜蛋白具有較高的同源性，因此推測(cè)FcPT2 是這類圍食膜蛋白，在不同組織中發(fā)揮著不同的作用.WSSV 感染實(shí)驗(yàn)證明FcPT2 可能在中國(guó)明對(duì)蝦應(yīng)答WSSV 侵染中發(fā)揮了重要作用，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究.