納米孔電化學技術中的動力學研究

李旭揚，鄒佩琨，劉 輝，柯 瀟

（華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

納米孔電化學技術在1989年由David，George，Hagan在研究測定 DNA序列時首次被提出，1995年，首次申請納米孔電化學技術的專利。在2014年，MinlON作為一個利用納米孔技術測定DNA序列的儀器被公開，在2015年，該儀器被證實能夠完整地測出大腸桿菌基因組，準確率達到98%以上。［1］

1 基本原理

納米孔電化學技術是以電解池為基礎，在一個電解池中放入正負兩個Ag／AgCl電極，在電解池中加入KCl溶液電解質，在電壓的作用下，電解池中正負離子會分別往正負電極移動。在充滿電解液的腔內，納米級大小的小孔的絕緣防滲膜將整個電解池分成兩個區域，一側加入所要檢測的物質，檢測的分子在電壓的作用下，會被納米孔道所捕獲，當檢測的分子被納米孔道捕獲并通過孔道時，由于檢測的小分子的結構、與其他離子不同，會瞬間改變孔道中的離子流，當待測分子通過納米孔道之后，孔道中的離子流恢復成原先狀態，這時候一個完整的峰就會出現。

2 動力學結合觀測反應機理

2.1 二硫鍵與巰基的反應

在2003年，Hagan Bayley課題組首次利用納米孔電化學檢測技術在單分子水平上在α-HL納米孔中實時觀測到了小分子與孔道之間的共價結合反應［2］。通過含有α-HL納米孔的磷脂膜將DTT和DTNB2-分離并使它們擴散到反應區，在孔道中實時觀測到到兩種小分子中其中DTNB2-分子上的巰基與α-HL納米孔117位置上的Cys側鏈上的巰基結合形成二硫鍵，DTT上的巰基將DTNB2-與α-HL納米孔所形成的巰基打斷，自身與α-HL納米孔形成二硫鍵，之后DTT分子中另一個巰基將與α-HL納米孔所形成的二硫鍵打斷與自身形成二硫鍵這整個共價鍵結合與斷裂的過程，并且該反應過程實現了多次循環，因此具有統計學意義。并通過測量二硫蘇糖醇二硫化物還原過程中產生的短壽命中間產物（RSSCH2CH（OH）CH（OH）CH2SH，為硫代酯）的分解速率常數來證明該方法的實用性，在研究的過程中，將納米孔電化學檢測技術與動力學理論相結合，通過納米孔電化學檢測技術成功捕捉到每個反應步驟的電信號，再從動力學的角度從每一步驟的反應速率常數推導出每一個信號所代表的反應過程中分子的結構，兩者相結合，從而推導出整個反應的反應機理。在2012年。Hagan課題組在研究了巰基的連接與斷裂的基礎上利用α-HL納米孔，從單分子角度上觀測了RSNO類分子在α-HL孔內，腔內的巰基打斷了RSNO類分子中的硫氮鍵，使RSNO類分子中的硝基取代了腔內的巰基上的氫原子，使硝基固定在了孔中，在此基礎上研究了硝酰二硫化物中間體RSN（O）SR-在反硝化過程中的壽命，研究了反硝化和S-亞硝基谷胱甘肽硫醇化之間的競爭，也研究了RSNO類分子與亞硝酸鹽之間的反應［3］。

2.2 有機砷（III）化合物與硫醇的反應

2003年Hagan Bayley課題組［4］利用突變的α-HLnm孔（一個突變的半胱氨酸殘基，取代了天然的蘇氨酸-117）在孔道內實時觀測到了有機砷（iii）類化合物與硫醇的反應。在實驗中，有機砷化合物在溶液中在電壓的作用下被納米孔所捕獲，而硫醇則通過定點結合到溶血素蛋白孔的腔面上。通過納米孔檢測到了該反應在單分子水平上的可逆共價鍵形成。從動力學的角度去研究，推導出正逆向反應的反應速率常數，從而推導出了有機砷（iii）化合物與硫醇的反應機理。2014年Hagan Bayley課題組［5］利用納米孔道技術，將砷的化合物與α-hemolysin孔腔中117位置半胱氨酸殘基上的巰基反應，得到了兩個對映異構體，再分別加入L-青霉胺與谷胱甘肽，揭示了他們會與異構體發生取代反應的過程以及過程中的手性轉化，在同時加入L-青霉胺與谷胱甘肽，研究通過得到的7種信號，在從動力學角度，利用測得的正負反應速率推出了7種信號所對應的化合物，揭示了L-青霉胺與谷胱甘肽與異構體發生反應時的反應過程以及手性轉化。在2015年的時候，Hagan課題組以有機砷（III）化合物與硫醇的反應為基礎，將此反應與動力學相結合，應用于分子機器領域，在α-HL孔道中構建了一串由5個半胱氨酸殘基連接而成的立足點，由4-硫苯胂酸（SPAA）和2-（2-甲氧基乙氧基）乙硫醇（MEET）合成有機砷（III）分子SPAA-MEET2，在孔道中受到乙硫醇溶液的可逆性競爭配位時，可以在相鄰兩個立足點形成三元環狀態，并且配位解離過程是隨機的，故該分子可以在這一串立足點上隨機性的上下運動，有機砷（III）與可交換硫醇分子配體沿著5個立足點的軌跡的運動可以在一個蛋白質納米反應器中被連續監測。［6］

3 總結

綜上所述，可以看出，在用納米孔電化學技術去觀測研究一個反應的反應機理時，在捕獲到反應過程中的各個階段的信號后，需要從動力學角度，從各個步驟的速率常數去推導整個反應機理，在這幾十年來，納米孔電化學技術已經逐步的從單純的檢測深入到去研究反應機理，并再次基礎上將其應用到研究手性轉化，分子機器與分子合成等領域。