抗生素、重金屬和殺生劑抗性共選擇機制

陳帥，鄒海燕，高方舟，吳黛靈，張敏，何良英,*，應光國

1. 華南師范大學環境研究院，廣東省化學品污染與環境安全重點實驗室&環境理論化學教育部重點實驗室，廣州 510006 2. 華南師范大學環境學院，廣州 510006

抗生素是由真菌、細菌或其他生物在繁殖過程中所產生的一類具有殺滅或抑制微生物生長作用的物質[1]。抗生素因其可以有效預防和治療由細菌導致的疾病問題而得到大量的使用，近年來臨床與農業生產中抗生素濫用與隨之產生的抗性問題受到廣泛關注[2-5]。據調查，我國2013年抗生素總產量估計為24.8萬噸，總使用量約為16.2萬噸，獸用抗生素的消費量占比從2007年的46%增加到2013年的52%[6]。當前抗生素抗性已成為全球公共健康領域的重大挑戰，也是世界各國政府和社會廣泛關注的問題[7-8]。為了應對抗生素抗性帶來的挑戰，我國發布了《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016～2020年)》。

細菌抗性的形成機制及其選擇壓力是遏制細菌耐藥的關鍵之一，也是近年來的研究熱點。對環境中抗生素殘留和細菌抗生素抗性的研究發現，二者之間存在著較強的相關性，從各種途徑排入到水環境中的抗生素改變了細菌群落結構，提高了總體的抗性水平，抗生素成為導致細菌產生抗藥性的重要選擇壓力[9]。研究發現，細菌產生抗生素抗性主要機制有外排泵系統、膜通透性改變、改變靶標點、酶修飾及降解作用以及產生應激反應改變生理特性作用，其中關于外排泵系統的研究較為豐富，并且值得注意的是，抗生素抗性的選擇壓力不止來源于抗生素本身，其他化學物質如金屬和殺生劑也參與了抗生素抗性的共同選擇[10-12]。殺生劑是一類無機或合成有機分子，用于對物體和表面進行消毒或滅菌，并保護材料或工藝不受微生物降解，如抗真菌劑、驅蟲劑、尼泊金酯類防腐劑和消毒劑等。一般認為，殺生劑的作用機制主要為氧化作用、親電體作用和溶解細胞膜[13]。研究發現，細菌對抗生素和殺生劑具有相似的抗性機制，其中外排泵機制最為重要[14-22]。此外，重金屬在環境中難以降解且容易發生富集而長期穩定存在，可對細菌群落對藥物的抗性產生持續選擇壓力[12]。細菌對重金屬抗性機制主要包括外排泵系統、金屬螯合與生物轉化作用[23-25]。越來越多的研究證明，細菌不但可以單獨對某一種藥物產生抗性，也可以通過協同抗性、交叉抗性和共調控抗性等多種機制產生多重抗性[26-28]。由此可見，細菌抗性的研究不僅要關注抗生素的使用和抗生素的直接選擇壓力，也要考慮多種物質共同作用機制。

抗生素的大量使用促進了細菌抗性的產生，然而環境中不止殘留著大量抗生素，也存在著大量重金屬和殺生劑等可進一步影響細菌抗性的物質。因此，研究細菌產生抗生素抗性的機制以及各種化學物質對細菌抗生素抗性的作用顯得尤為重要。本文闡述了細菌對抗生素、重金屬和殺生劑的抗性機制，以及多種選擇壓力的共同抗性研究進展，旨在綜述多重抗性共選擇的研究現狀，剖析細菌產生抗性的機制，為抗生素抗性研究探討新思路和新方法。

1 環境中的選擇壓力及其抗性機制(Chemical selection pressure in the environment and resistance mechanism)

我國是抗生素生產和使用大國，環境中抗生素含量較高，2013年我國抗生素總使用量約為16.2萬噸，其中人用抗生素占到總量的48%，其余為獸用抗生素。其中36種常見抗生素總使用量達到9.27萬噸，其84.3%為獸用抗生素用量，經過人和動物體內代謝作用后，由糞便和尿液排泄的抗生素總量為5.4萬噸，進一步通過各種污水處理后，共有5.38萬噸進入受納環境中[6]。不止抗生素，環境中同樣存在著大量重金屬和殺生劑殘留。對珠江三角洲地區沉積物和河水中重金屬的檢測表明，大部分沉積物均受到嚴重的鎘、鉛和鋅污染；珠江水體的重金屬含量普遍在高于Ι類水標準的μg·L-1級[29-31]。三氯生和三氯卡班是常見的殺生劑，用于牙膏和洗手液等多種產品中，在水環境中廣泛檢出，對我國遼河、海河、黃河、珠江和東江五大河流的監測發現，在五大河流中均檢測到三氯生和三氯卡班，幾乎每條河流的地表水和沉積物中三氯生和三氯卡班的檢出率均為100%或接近100%，三氯生和三氯卡班在地表水中的濃度分別為478和338 ng·L-1，在沉積物中的濃度分別為1 329和2 723 ng·g-1[32]。環境中普遍存在的這些抗生素、殺生劑和重金屬成為誘導環境中細菌抗性的重要因素，導致細菌通過各種不同的機制對這些選擇壓力產生抗性。

1.1 外排泵功能

細菌抗性機制中研究較為豐富的是外排泵功能，細菌通過在細胞膜上產生特定的轉運蛋白，使藥物等進入細菌內部后還未發揮作用就被排放到細菌體外，從而產生抗性(圖1)。通過核苷酸序列分析，預測qacA基因編碼一個包含514個氨基酸的Mr55017蛋白，該蛋白具有典型的細胞膜蛋白的性質，分析表明，這些蛋白質的N-和C-端區分別參與能量耦合(質子轉移)和底物運輸，并且被證明屬于運輸蛋白家族，通過轉運蛋白對四環素和亞甲基霉素產生抗性[33]。與抗生素外排相似，金屬外排泵也使細菌擁有了金屬抗性，利用單分子超分辨成像和基因工程技術研究大腸桿菌發現，細胞中的三聯復合外排泵CusCBA配合物是一種動態結構，周質銜接蛋白CusB是一種金屬傳感元件，它在cus操縱子的轉錄激活之前驅動外排復合物的形成，以產生金屬抗性[25]。

同樣，在殺生劑抗性中外排泵機制也被證明具有重要作用，有研究發現，根據RNA測序數據分析，戊二醛暴露誘導外排泵產生和膦酸鹽降解，同時影響脂質和多胺的生物合成代謝，此外，對外排泵進行化學抑制發現戊二醛活性增強，表明外排泵有助于戊二醛抗性[20]。這些研究說明，外排泵功能是細菌產生抗性的重要機制。

1.2 細胞膜通透性改變

另一種重要的抗性機制是改變細胞膜通透性，細菌通過調節控制細胞膜的結構，選擇性地減少或禁止某些化學物質進入細菌細胞內，從而產生對該化學物質的抗性(圖1)。細菌可以通過突變而改變外膜中外膜孔蛋白和脂多糖的滲透性，從而產生四環素抗性[34]。對于殺生劑抗性的研究也表明，膜通透性改變可以提高細菌的殺生劑抗性，Bisbiroulas等[14]將單核細胞增生李斯特氏菌在苯扎氯銨作用下生長的極性和中性脂類成分進行分析，并將其與最佳生長細胞進行比較發現，細菌通過調整脂質變化導致膜流動性降低，并且還導致細胞表面的物理化學性質的改變，從而改變細菌對非生物物質表面的粘附，產生了對殺生劑的抗性。而另一種通過蛋白質組學方法分析殺生劑抗性的實驗也發現，受苯酚壓力選擇的大腸桿菌的外膜蛋白OmpA、FadL、LamB和OmpT，細胞質相關蛋白AceA和EF-Tu，內膜蛋白AtpB，推斷的衣殼蛋白Q8FewO和未知位置蛋白Dps蛋白質也發生改變，從而使細菌產生了對苯酚的抗性[19]。

1.3 改變作用靶標點

細菌還可以通過干擾或限制抗生素等化學物質的靶標位點，使其殺菌作用降低或受到抑制，從而產生抗性(圖1)。例如大環內酯類、林可酰胺和鏈霉素抗生素在化學結構上是不同的，但有相似的作用模式，細菌通過修飾它們在核糖體上的靶標點，特別是23S rRNA的結構域中腺嘌呤殘基的甲基化，使抗生素藥物無法作用到正確靶標點，從而產生抗性[35-37]。改變靶標點同樣是殺生劑抗性的一種重要機制。在大腸桿菌中，FabI突變轉化為FabI[G93V]，而FabI可以與蛋白質和三氯生形成穩定的三元結構，突變后的FabI[G93V]則影響了三氯生在細胞中的穩定結構，使三氯生更容易被去除，從而產生對三氯生的抗性[16]。

1.4 酶修飾和降解作用

細菌可以產生針對某些種類抗生素或殺生劑的修飾酶或降解酶，當這些化學物質進入細菌細胞后，首先被相應的酶作用水解或者修飾，或者被一些生化作用降解，從而無法起到殺菌作用，導致細菌產生抗性(圖1)。Cagliero等[38]使用紅霉素和泰樂菌素在體外選擇空腸彎曲桿菌和彎曲桿菌的大環內酯抗性突變體，發現這些突變體通過在核糖體蛋白L4(G74D)和L22(插入位置86或98)中表現出修飾作用而產生抗生素抗性。細菌對殺生劑的這一抗性機制主要是通過生化降解作用。Meade等[17]從堆肥、水和土壤樣品中分離到對三氯生具有高度抗性的惡臭假單胞菌和木糖氧化無色桿菌反硝化亞種，利用含有三氯生的培養基進行細菌培養實驗，通過高效液相色譜法結合生物測定證明，三氯生在液體培養物中被滅活或失去效用。Nishihara[18]也發現從城市污水處理廠的活性污泥中分離到的一種假單胞菌可以通過N-脫烷基化降解作用對季銨類化合物產生高度抗性。

1.5 應激反應及改變生理特性

與4種常見抗性機制不同的是，最近的一些研究發現，細菌還可以通過生理代謝變化降低細胞對殺生劑的敏感性，比較常見的現象為營養限制、降低生長速率和防止殺生劑進入下層細胞[22,27]。Muoz等[39]對比了益生菌戊糖乳桿菌MP-10暴露于亞致死濃度的抗生素(阿莫西林、氯霉素和四環素)和殺生劑(苯扎氯銨和三氯生)2種環境的抗性表現，并利用蛋白組學分析發現，戊糖乳桿菌MP-10對抗生素產生的適應性表現為蛋白質合成相關基因的表達增加、碳水化合物代謝及能量生產的相關基因的表達下降，對殺生劑的適應性表現為磷酸化載體蛋白HPr和氧化還原酶相關編碼基因表達的下調，但它們的共同點在于蛋白質合成基因的過量表達，這些生理代謝共同的適應性使細菌對抗生素和殺生劑產生了抗性(圖1)。

1.6 金屬螯合與生物轉化

金屬螯合與生物轉化作用是細菌針對重金屬產生的抗性機制，而近些年的研究發現，重金屬抗性與抗生素抗性密切相關[26]。關于細菌對重金屬的抗性，研究發現，由mer操縱子編碼的細菌抗汞機制中，進入細胞膜的Hg2+先與Hg2+結合蛋白結合，將結合的汞傳遞給位于細胞質膜中的汞運輸系統，該系統允許汞向細胞內的易化擴散，隨后非細胞汞(Hg2+)被細胞質汞還原酶還原為無毒的0價汞從細胞中揮發，防止了Hg2+對細胞的損傷(圖1)[23]。在另一項研究中，由于細胞壁上存在磷酸二酯基、羧基、糖羥基和酰胺基等許多陰離子位點，使枯草芽孢桿菌細胞壁與多種金屬(Hg2+、Pb2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Na+和K+)結合，結合后的金屬失去了生物毒性[24]，所以使細菌產生重金屬抗性(圖1)。

2 細菌對多種選擇壓力的共選擇機制(Resistance mechanism of bacteria to multiple selection pressures)

重金屬、殺生劑和抗生素都是具有抗菌作用的物質，具有相似的抑菌/殺菌手段，所以，細菌可以同時對它們產生抗性，且可能具有相似的選擇和共存機制，與單一化學物質抗性相比，細菌的多重抗性機制更為復雜，研究較多的則是協同抗性(共抗性)、交叉抗性和共調控抗性。

2.1 協同抗性(共抗性)

當不同抗性表型的基因位于同一遺傳元件(如質粒，轉座子或整合子)上時，就會發生共同抗性[40]。Buffet-Bataillon等[41]通過調查發現，dfrA、sul1和qacEΔ1基因盒的存在與對復方新諾明的抗性和季胺類殺生劑的最小抑菌濃度(MIC)值相關。Zhang等[42]對金黃色葡萄球菌LZ-01的研究發現，經鉻酸鹽或氨芐青霉素處理后的細菌，基因組和轉錄組EmrA和EmrB基因水平都會相應上調，使細菌對鉻和氨芐青霉素的抗性增加，在將EmrA和EmrB基因扣除后，這種誘導現象消失，表明EmrAB操縱子賦予了細菌在生存環境中對鉻酸鹽或氨芐青霉素的共抗性。另外，對于攜帶多種抗性基因質粒的研究已有許多報道，Fang等[43]研究發現，pco和sil操縱子、oqxAB/blaCTX-M共存于IncHI2質粒上，含有這一質粒的細菌表現出對重金屬和抗生素的共抗性(圖2)。另一項研究表明，質粒pUUH239.2編碼對β-內酰胺類抗性(blaCTX-M-15、blaTEM-1和blaOXA-1)、氨基糖苷類抗性(aac-(6')-1b-cr和aadA2)，四環素類抗性(tet(A)和tetR)、甲氧芐氨嘧啶類抗性(dhfrXII)、磺胺類抗性(sul1)、季銨化合物類抗性(qacEΔ1)、大環內酯類抗性(mph(A)-mxr-mphR(A))和重金屬離子(銀、銅和砷)抗性，這種同時編碼對抗生素、殺生劑和重金屬抗性的質粒的存在對細菌多重抗性有重要作用[44]。

2.2 交叉抗性

交叉抗性是指細菌通過同一種抗性機制可以同時對抗生素、殺生劑和重金屬等產生抗性[45]。已有研究證明，由于應激反應增強導致喹諾酮類藥物與其他抗菌藥物(包括三氯生)之間的交叉抗性[46-47]。外排泵功能作為一個重要的抗性機制，在交叉抗性機制中也占據主導地位。由3個基因操縱子(cmeABC)編碼的外排泵與已知的三重多藥外排泵具有顯著結構同源性，它由周質融合蛋白(CmeA)、內膜外排轉運蛋白(CmeB)和外膜蛋白(CmeC)組成，有助于空腸彎曲桿菌野生型81-176菌株中的多重抗性[48]。且后續實驗發現，cmeDEF編碼的外排系統對包括氨芐青霉素、溴化乙錠、吖啶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鹽、三氯生和西曲酰亞胺等具有多重抗性[49]。關于在外排泵功能中常見的RND型多蛋白外排機制，Conroy等[50]研究發現，ges編碼系統與RND型蛋白外排系統密切相關，且ges系統具有較為廣泛的底物特性，可以同時將重金屬和抗生素類藥物排出細胞外。而對于另一具有外排功能的MexAB-OprM系統，Schweizer[51]采用一種基于酵母FLP重組酶的新技術，驗證了MexAB-OprM系統是銅綠假單胞菌對藍藻素和硫代乳霉素的內源性耐藥系統，且該系統同時可以排出具有廣譜殺菌作用的三氯生。另有研究證明，在鼠傷寒沙門氏菌中BaeSR系統通過誘導AcrD和MdtABC藥物外排系統增加沙門氏菌的多重抗性和金屬抗性(圖2)[52]。Shahcheraghi等[53]通過基因克隆，將含有編碼多藥外排功能smfY基因的質粒轉移到宿主細菌，觀察細菌抗性發現，宿主菌對諾氟沙星、苯扎氯銨、吖啶黃和溴化乙錠的MIC顯著增加。另一誘導實驗發現，大腸桿菌產生應激反應或對苯扎氯銨和抗生素適應性增強，導致大腸桿菌表征出對苯扎氯銨和抗生素的獲得性交叉抗性，其中外排功能的增強在具有抗性的細胞中明顯增加[54]。

2.3 共調控抗性

細菌的生命活動依靠各種胞內組織的共同調節，當細菌暴露于選擇壓力之下時，會將轉錄翻譯過程聯系起來，通過應激協調反應產生抗性[26]。Navarre等[55]發現調節基因slyA和phoP/phoQ在沙門氏菌對藥物產生的抗性中起關鍵作用，slyA的主要作用是改變細胞表面以保護細胞免受宿主產生的有毒化合物的影響(圖2)。Perron等[56]通過亞抑制濃度或亞致死濃度誘導實驗，證明了雙組分調節基因czcR-czcS與銅綠假單胞菌的重金屬抗性和碳青霉烯抗生素抗性有關。Balasubramanian等[57]的研究證明，ampR的丟失導致了藥物對細菌作用的增強，這表明在β-內酰胺抗性、藻酸鹽生產、群體感應基因和毒性因子產生之間存在著一個共同調節網絡，其中ampR起著核心作用。與此相似，acrD和mdtABC基因的共同缺失抑制了baeR介導的多重抗性，而單個基因的缺失并不能抑制baeR介導的多重抗性，證明BaeR調節系統通過誘導AcrD和MdtABC外排系統增加了沙門氏菌的多重抗性[52]。最近的一項實驗發現，三氯生可誘導野生型大腸埃希菌通過共調控作用產生多重抗性，三氯生誘導的氧化應激導致fabI、frdD、marR、acrR和soxR等基因的突變，引起編碼β-內酰胺酶和多藥外排泵基因轉錄的上調，以及膜通透性相關基因的下調[58]。

3 重金屬和殺生劑對細菌抗生素抗性影響的研究現狀(Research status of the effects of heavy metals and biocides on bacterial antibiotic resistance)

重金屬對細菌抗生素抗性影響的研究，過去主要采用誘導實驗的方法觀察細菌抗生素抗性的變化，并且發現受重金屬刺激的細菌更容易在抗生素環境中存活；后期的研究專注于與表型相關的基因及其表達的情況，證明了環境污染濃度的重金屬暴露可以提高細菌的抗生素抗性[59-61]。與重金屬的環境污染濃度下細菌抗生素抗性的變化相比，現在的研究更關注于環境濃度及亞抑制濃度下細菌抗生素抗性的變化，并且抗性的持續性問題成為研究熱點。一些實驗證明，低濃度的重金屬共選擇作用提高了環境中抗生素抗性基因(ARGs)的豐度，改變了細菌群落結構，使細菌整體抗性水平增強，且在去除重金屬后，這種抗性水平會維持較長時間，在土壤環境中這種抗性甚至會持續幾十天[61-63]。最近研究發現，在亞抑制濃度Cu2+暴露下，細菌細胞內產生過量的活性氧(ROS)，提高了細菌的接合頻率，從而增強了抗生素抗性基因的水平轉移[64]。此外，環境濃度Cu、Ag、Cr和Zn的暴露，不僅促進了細菌內ROS的形成，使得細胞產生應激反應，也對膜完整性造成損害，從而增加了脂質相關rfaZ、rfaq、pmrD、htrL和plsX等的表達，從而促進抗生素抗性基因的水平轉移[65]。由此可見，亞抑制濃度重金屬對細菌的抗生素抗性具有促進作用，其中ROS的產生被認為是重金屬促進抗性基因水平轉移的原因之一[64-65]。

重金屬對細菌抗生素抗性的促進作用已被廣泛認可，但目前對于殺生劑與抗生素抗性的相關性存在一些爭議。已經有多項研究表明，殺生劑抗性與抗生素抗性之間并無直接關聯性，對從環境樣品中分離的抗性細菌的調查分析顯示，來自動物糞便、含氯自來水和臨床菌株等多種途徑的細菌可以同時對多種抗生素和殺生劑產生抗性，但2種抗性之間僅存在弱相關性[66-68]。這種2種抗性之間相關性分析很明顯，不能成為殺生劑與抗生素抗性間作用的有效證據，更多的誘導實驗及基因層面的機理研究準確地說明了殺生劑對抗生素抗性的促進作用。一些調查分析表明，殺生劑與細菌抗生素抗性密切相關。在空氣和水體環境中的調查發現，殺生劑的存在往往提高了環境中ARGs的豐度，且抗生素抗性呈現隨殺生劑濃度升高而增強的現象[69-70]。Liu等[70]對暴露于消毒副產物中的銅綠假單胞菌的抗生素抗性研究表明，殺生劑暴露使細菌對10種單獨抗生素和多種抗生素的抗性均有不同程度的提高，與對照相比，對諾氟沙星和多霉素B抗性增強甚至超過10倍。對這些抗性表型的作用機制研究發現，SmeT是多藥外排系統SmeDEF的一種阻遏物，三氯生與SmeT結合，降低了SmeT對SmeDEF的抑制作用，提高了SmeDEF在細胞內的表達，從而提高抗性[71]。不止這種化學結合作用，殺生劑還可以通過誘導而導致多藥外排泵AcrAB-TolC突變，該突變與多重抗性表型有關，使細菌對喹諾酮類抗生素和殺生劑三氯生均產生高度抗性[72]。最近的一項實驗發現，2種常見的水消毒副產物(亞氯酸鹽和碘乙酸)具有選擇抗生素抗性的作用，導致在高(接近MIC)和低(亞MIC)暴露濃度下抗性大腸桿菌菌株的突變，且亞抑制濃度的消毒副產物暴露產生的抗性高于MIC暴露濃度下產生的抗性[73]。綜上，可以看出殺生劑可以誘導抗生素抗性增強，但對于這種抗性在環境中的持續性問題研究較少，Li等[74]將革蘭氏陰性菌大腸桿菌長期暴露于環境濃度的三氯生中，檢測分析細菌基因組和轉錄組信息發現，由于靶基因的過度表達和突變導致細菌對三氯生的抗性明顯增強，且在停止暴露后細菌由于可遺傳的基因突變，適應細胞對三氯生表現出持續的抗性；而在暴露過程中細菌的抗生素抗性變化不大，暴露停止后會隨著時間的推移而下降。而關于殺生劑促進抗生素抗性傳播的研究，目前僅有一篇文獻介紹了在對供體菌和受體菌共同培養的條件下，三氯生和洗必泰顯著增加了抗生素抗性的轉移頻率，促進了抗生素抗性的水平傳播[75]。

從目前研究來看，對于環境中的重金屬和殺生劑對細菌抗生素抗性的研究，首先通過細菌誘導實驗觀察其抗性表型，其次結合分子生物學和測序技術，分析細菌基因組、轉錄組和蛋白組信息，深入研究細菌產生抗生素抗性的基因型和抗性表型[59-61,66-71]。一般認為高濃度暴露更容易產生細菌抗生素抗性[59-61]，但近些年來發現，亞抑制濃度暴露也是促進細菌抗生素抗性及多重抗性的關鍵因素[73-74]，并在此基礎上進一步分析了細菌抗生素抗性的持久性[61-63]，以更好評估重金屬和殺生劑帶來的抗生素抗性的環境影響。其中，抗性基因的水平轉移是目前重金屬和殺生劑對細菌抗生素抗性影響研究的重點[64-65,75]。

4 研究展望(Research prospect)

重金屬和殺生劑已成為推動細菌抗性增長的重要因素，但目前的研究仍存在一些不足，主要表現在：(1)缺乏多種選擇壓力共選擇實驗研究。目前有關選擇壓力脅迫產生抗生素抗性的研究多是采用單一化學物質暴露的實驗，而環境中更多的情況是多種選擇壓力并存，進一步研究多種選擇壓力對細菌抗生素抗性的共選作用及機制有利于應對細菌抗性問題。(2)驅動機制研究不足。雖然已有足夠證據表明細菌可以通過多種作用機制產生多重抗性，但驅使這種多重抗性產生的機制仍不清楚；另外，雖然已有部分研究證明重金屬和殺生劑可以驅動抗生素抗性水平傳播，但其傳播機制和誘導傳播的機制尚不明確。抗生素抗性研究已涉及微生物學、分子生物學和生物信息學等多個學科領域，因此，有必要利用多學科研究手段對細菌抗性的形成機制、選擇壓力和驅動機制開展深入研究。