TNFSF14對STZ誘發Ⅰ型糖尿病的影響及其機制初探①

江 沛 李 由 徐 砜 許桂蓮 李桂清 ( 陸軍軍醫大學西南醫院腎科,重慶 400038)

Ⅰ型糖尿病 (type 1 diabetes mellitus，T1DM) 是一種自身免疫性疾病，它是由機體對自身抗原的免疫反應不當而引起的，它由活化的T細胞損傷自體胰島中的β細胞，使之不能正常分泌胰島素，導致胰島素的絕對缺乏[1,2]。

TNFSF14是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor super-family,TNFSF )中的一員,又稱LIGHT或 HVEM-L，其可由樹突狀細胞、巨噬細胞、NKT等多種細胞產生[2]。TNFSF14含有 254個氨基酸，既可為膜結合型分子，又可作為可溶性分子，主要通過與 LTβR(TNFRSF3)和 HVEM(TNFRSF14)兩種受體結合，在腫瘤免疫、炎癥反應、自身免疫性疾病的發生及胸腺陰性選擇等過程中發揮重要的生物學作用[3]。TNFSF14缺陷小鼠 (TNFSF14 konckout，TNFSF14 KO小鼠) 具有正常的外周淋巴器官，它通過對免疫細胞的影響或通過參與炎癥過程在調節宿主免疫應答中起著重要的作用[4]。

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ) 是一種DNA烷基化試劑，能通過GLUT2葡萄糖轉運蛋白獨自進入細胞，對胰島中的β-細胞具有毒性，根據劑量的不同常用于誘導實驗動物的各型糖尿病模型[5,6]。

鑒于TNFSF14與其受體HVEM和LTβR對于機體免疫具有重要的調節作用，而目前尚未有文獻闡述其對Ⅰ型糖尿病進程的影響。因此，本文以STZ誘導的T1DM小鼠為模型，探討TNFSF14在Ⅰ型糖尿病中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料、試劑 STZ (Sigma) ；檸檬酸(國藥集團)；檸檬酸鈉(國藥集團)；血糖儀(強生穩豪)；蘇木素-伊紅染色液(碧云天)；FITC標記的抗小鼠CD3、PE標記的抗小鼠CD4以及APC標記的抗小鼠FoxP3流式抗體均購自Biolegend公司。

1.1.2實驗動物 23～25 g體重雄性SPF級C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；TNFSF14 KO小鼠(C57BL/6背景)為德國Kfeffer博士惠贈，在動物房潔凈層柜(IVC系統)內飼養，恒溫、恒濕條件下自由攝食飲水[2]。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型糖尿病小鼠模型的建立 C57BL/6小鼠按照55 mg/kg的劑量，腹腔注射STZ，連續注射5 d，根據血糖變化情況每周測量2～3次血糖，直至趨勢穩定為止[5,6]。

1.2.1.1pH=4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的配制 檸檬酸(FW:210.14) 2.1 g加入雙蒸水100 ml 中配成A液 檸檬酸鈉 (FW:294.10) 2.94 g加入雙蒸水100 ml中配成B液用時將A、B液按1.2∶1混合，pH計測定pH值,調節pH=4.2～4.5，即是所需配置STZ的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。

1.2.1.2含1% STZ 的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的配制 用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制濃度為1%的STZ，即是1 ml 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中溶解0.01 g(10 mg)STZ。

1.2.1.3注射劑量的計算 按照小鼠體重20 g 、劑量55 mg/kg計算，需要體積為100 μl的含1% STZ 的 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。

1.2.1.4注射前的準備 第一次注射前應禁食4 h，稱量禁食后體重。注射時用檸檬酸緩沖液溶解STZ，放在冰上，錫箔紙避光，按空腹體重注射相應的STZ，并在30 min內注射完畢，因為STZ的水溶液極不穩定[2,7,8]。

1.2.1.5模型建立成功的驗證 C57BL/6作為STZ的敏感型動物，從第五次注射后的當天開始取尾靜脈血測血糖，直到連續2 d血糖超過13.89認為模型建立成功[7,8]。

1.2.1.6實驗標本的獲取 STZ最后一次注射23 d后，脫頸處死小鼠，取出胰腺、脾臟及胰腺淋巴結，將胰腺用4% 多聚甲醛溶液固定；脾臟及胰腺淋巴結置于200目篩網上研磨，紅裂液裂解紅細胞，50 ml PBS洗滌2次，5 ml PBS重懸，制成單細胞懸液。

1.2.2HE染色及評分 取固定好的胰腺，石蠟包埋并連續切片，做蘇木素-伊紅(HE)染色。采用雙盲法在光鏡下隨機觀察每只小鼠胰腺HE染色后的3～5個胰島并評分，評分標準按照炎癥浸潤的程度進行量化評價：0分，無炎癥細胞浸潤；1分，浸潤百分比<25%；2分，浸潤百分比25%～50%；3分，浸潤百分比>50%。

1.2.3流式細胞術 檢測兩組小鼠脾臟和胰腺淋巴結細胞中的細胞亞群(CD3+T細胞、CD4+T細胞以及CD4+FoxP3+調節性T細胞)的百分比。將脾臟和胰腺淋巴結制備成單細胞懸液，然后進行染色：加入FITC-CD3、PE-CD4和APC-FoxP3抗體，避光、冰上孵育25 min，流式洗液洗滌2次。流式細胞儀(BD FACS CantoⅡ)檢測各亞群的百分率。

2 結果

2.1TNFSF14 缺陷顯著下調STZ誘導的Ⅰ型糖尿病的發生 在最后一次注射STZ后，我們通過監測血糖發現TNFSF14 KO 小鼠的血糖整體升高緩慢，相比之下，WT組升高迅猛，在處死小鼠前已經全部超過正常血糖值(圖1，虛線為血糖臨界值)。HE結果可以看出，TNFSF14 KO組的胰島清晰可見，結構完整，而WT組中胰島被大量破壞，并且有大量炎癥細胞浸潤(圖2A、B)。提示TNFSF14在Ⅰ型糖尿病的病理發生中起關鍵作用。

2.2與WT組相比，TNFSF14 KO小鼠脾臟和胰腺淋巴結淋巴細胞中CD3+T細胞的百分比明顯下調 前面的結果已經證明TNFSF14通路在Ⅰ型糖尿病的進程當中發揮關鍵作用，為進一步探討其介導Ⅰ型糖尿病的機制，我們采用流式細胞術檢測兩組小鼠脾臟和胰腺淋巴結中CD3+T細胞和CD4+T的百分比。結果表明，TNFSF14 KO組脾臟及胰腺淋巴結中的CD3+T細胞明顯高于WT組(P<0.05)(圖3A)，而CD4+T細胞百分比無顯著差異(圖3B)。

圖2 HE檢測WT和TNFSF14 KO小鼠的胰腺病理變化及評分Fig.2 Pathological changes and scores of pancreas in WT and TNFSF14 KO mice were detected by HE stainingNote: A.HE Staining (×400).n=5 cells/ground；B.Score of pathological changes in the pancreas tissue.*.P<0.05.

圖4 WT和TNFSF14 KO小鼠脾臟及胰腺淋巴結淋巴細胞中CD4+FoxP3+調節性T細胞亞群的百分比Fig.4 Percentage of CD4+FoxP3+regulatory T cell subsets in spleen and pancreas lymph nodes of WT and TNFSF14 KO miceNote: SP.Spleen；pLN.Pancreatic lymph node.*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3與WT組相比，TNFSF14 KO小鼠脾臟和胰腺淋巴結淋巴細胞中的CD4+FoxP3+調節性T細胞的百分比顯著升高 已有的文獻表明調節性T細胞是一群抑制性T細胞，它積極抑制免疫系統的激活，防止發生病理性的自我反應[9,10]，我們的結果表明，TNFSF14 KO組小鼠脾臟及胰腺淋巴結淋巴細胞中的CD4+FoxP3+調節性T細胞百分比顯著高于WT組小鼠(P<0.05)(圖4A、B)。

3 討論

Ⅰ型糖尿病，是一種胰島素絕對缺乏的糖尿病，它的病因涉及遺傳和環境因素的結合[11]，潛在的機制包括胰腺中產生胰島素的β細胞的自身免疫破壞[12]。目前還沒有預防Ⅰ型糖尿病的方法，如果不及時治療，糖尿病會引起許多并發癥，嚴重影響患者的生活質量，甚至危及生命。據估計，每年約有8萬名兒童患上這種疾病。

本文以STZ腹腔注射小鼠誘導Ⅰ型糖尿病為模型，探討TNFSF14在Ⅰ型糖尿病中的作用。結果表明注射STZ于WT小鼠后，血糖持續升高，在23 d后全組小鼠的血糖都超過了正常值，而TNFSF14 KO組小鼠的血糖上升顯著減緩，提示TNFSF14通路在Ⅰ型糖尿病的進程當中發揮重要作用。

為了進一步確定TNFSF14是如何參與Ⅰ型糖尿病的進程，我們流式細胞術檢測了經STZ誘導后的兩組小鼠的脾臟和胰腺淋巴結中細胞亞群的百分比。結果表明，TNFSF14 KO組脾臟及胰腺淋巴結中的CD4+FoxP3+調節性T細胞百分比均顯著低于WT組(P<0.05)。

免疫系統有一個重要功能就是能夠區分自我和非我，當自我/非我識別失敗時，免疫系統就會破壞自身的細胞和組織，從而導致自身免疫性疾病[13]。調節性T細胞積極抑制免疫系統的激活，防止病理自我反應，即自身免疫疾病。CD4+FoxP3+調節性T細胞是免疫抑制性的，抑制或下調效應T細胞的誘導和增殖[14]，由此我們推測TNFSF14通過下調調節性T細胞的分化來介導Ⅰ型糖尿病的發生，其具體的分子機制需進一步探討。

綜上所述，我們的研究結果表明，TNFSF14在Ⅰ型糖尿病的病理發生中發揮重要作用，其可能通過抑制CD4+FoxP3+調節性T細胞的分化來介導Ⅰ型糖尿病的發生。