依達拉奉對急性腦梗死大鼠的保護作用及生長分化因子15的影響①

焦光美 單海雷 馬 征 張曉璇 康玲伶 竇志杰 王 東 楊 寧 趙 亮

(承德醫學院附屬醫院神經內科,承德 067000)

急性腦梗死是一個嚴重威脅生命及生活質量的因素，尤其對于老年人及三高人群，是導致死亡和致殘的主要原因。該病變給患者及其家庭造成了嚴重的經濟負擔及精神負擔，因此也引起了社會的廣泛關注[1]。急性腦梗死會造成機體多方面的損傷。缺血性腦卒中損傷中氧化應激是一個重要而持續造成損傷的機體反應，依達拉奉是臨床上常用的一種自由基清除劑，在腦梗死急性期的臨床治療上有著較廣泛的應用[2,3]。依達拉奉可逆轉自由基誘發的細胞毒性作用從而發揮神經保護作用，并可保護脂質的氧化和避免細胞內皮進一步受損，起到減小梗死體積、減輕腦水腫、延遲神經元凋亡，避免神經功能過度損傷的作用。雖然臨床應用廣泛，但對于依達拉奉的作用機制仍然有很大的研究空間[4,5]。生長分化因子15(growth differentiation factor-15，GDF-15)是TGF-β超級家族中的一員，是反映心血管生理病理進程的獨立性生化標志物，并且與冠心病、心肌梗死關系密切。研究表明，GDF-15與多種心腦血管疾病的發生及進展有關[6]。基于此，本研究針對依達拉奉對急性腦梗死大鼠(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的保護作用是否與調節GDF-15的表達有關進行研究，并通過研究GDF-15下游蛋白Smad2的表達進一步闡明在急性腦梗死中依達拉奉的作用機制，發現依達拉奉可調節MCAO腦中GDF-15及其下游蛋白Smad2的表達。本研究結果為依達拉奉臨床應用的新作用機制提供科學證據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 成年雄性SD 大鼠，SPF級，購自北京維通利華實驗動物中心[合格證號：scxk(京)2013-0008]，體重250～300 g，共66只。持續保持動物實驗設施在屏障環境標準，室溫為18℃～26℃，溫差不超過4℃；維持相對濕度為40%～70%，光照每12 h替換；其余飼養條件都符合中華人民共和國國家標準GB14925-2010規定。

1.1.2試劑與儀器 依達拉奉注射液購自吉林博大制藥有限公司，批號：02-1608102。戊巴比妥鈉購自天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20161114；RT-PCR試劑盒購自美國promega公司；山羊抗人GDF-15多克隆抗體、鼠抗人Smad2單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；PCR儀購自美國TeehneTouehgene公司。

1.2方法

1.2.1MCAO 模型的制作 大鼠MCAO模型復制參考 Longa 等[7]的改良線栓法，所有大鼠均以線栓栓塞左側大腦中動脈。大鼠腹腔內注射1.5%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)進行麻醉,仰臥位固定后,去除頸部皮毛，皮膚表面消毒后于正中縱向切口，暴露左側頸總動脈并鈍性分離，用動脈夾暫時夾閉。結扎頸外動脈遠端并切斷，并將頸外動脈殘端結扎以阻止血流，松開夾閉頸總動脈的動脈夾，線栓由殘端插入頸外動脈，插入深度約17～19 mm 處，遇阻力則停止。頸前切口縫合并表面消毒。經多普勒血流儀檢測顯示顱內血流值低至基線值 30%以下，則表示大腦中動脈栓塞模型制備成功。假手術組動物進行相同的操作，但僅暴露血管，不進行栓塞。

1.2.2分組給藥 造模成功的大鼠共48只隨機分為模型組、依達拉奉低劑量組(1.5 mg/kg)、依達拉奉高劑量組(3 mg/kg)，并以假手術組作為對照。依達拉奉高、低劑量組在術后1 h給予不同劑量的依達拉奉注射液，假手術組、模型組給予等量生理鹽水，依達拉奉劑量及給藥時間參考文獻[8]和[9]設定，文獻報道尾靜脈注射依達拉奉3 mg/kg治療大鼠MCAO模型取得顯著的效果，因此我們使用依達拉奉3 mg/kg作為高劑量及參考方法使用0.5倍劑量作為低劑量探索其治療大鼠MCAO模型的機制。

1.2.3神經功能缺損評分 大鼠大腦中動脈閉塞4、10、24 h后，雙盲法由兩名實驗人員根據改良神經功能缺損評分標準進行大鼠神經功能評分[7]。標準：0分表示無缺陷；1分表示對側前肢不能完全伸展；2分表示對側前肢不能伸出；3分表示輕微的向對側轉圈；4分表示嚴重的向對側轉圈；5分表示向對側傾倒。

1.2.4TTC 染色及梗死體積測量 大鼠經神經功能缺損評分后TTC染色法進一步驗證依達拉奉對急性腦梗死大鼠的保護作用。腹腔注1.5%戊巴比妥鈉麻醉后快速取出大腦，立即將完整腦組織放入-20℃冰箱中，經過20 min冷凍后從前向后用大鼠腦切片模具將腦組織切成2 mm厚的腦片，共5片。將腦片輕放入預先配制的4%TTC染液中，并在37℃恒溫箱中避光染色10 min后，每隔5 min對腦片進行晃動、翻面一次，以使得腦片著色均勻。染色均勻后將腦片放入PBS溶液中洗滌去除多余染色液，將腦片用4%多聚甲醛溶液進行固定，24 h后即可拍照。使用Image J圖像分析軟件圈畫出梗死區域面積及全腦面積并進行計算，梗死體積=[(梗死對側體積-梗死側非梗死區體積)/梗死對側體積]×100%。

1.2.5GDF-15、Smad2 mRNA表達測定 造模24 h，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉致死，取大腦研磨后，加入Trizol 進行裂解，采用RNA 提取試劑盒分離提取大腦中的總mRNA。測定總mRNA 濃度，符合要求后，采用cDNA合成試劑盒合成模板cDNA并進行RT-PCR。測定GDF-15、Smad2 mRNA的表達水平。RT-PCR引物序列：GDF-15:Forward:5′-CATTGCCTAGCGAGCGACG-3′,Reverse:5′-GGTAGGCTTCGGGAGACC-3′;Smad2:Forward:5′-TCC-ACCCGGCACTACAATCT-3′,Reverse:5′-CCATCAC-CGACCATCAGACCTGG-3′。

RT-PCR實驗運用7500 system software分析結果，得出各組內參基因和目的基因的Ct值，相對定量采用2-ΔΔCt分析方法，設定模型組中目的基因與GAPDH的相對表達量為1，計算其他組別相對應模型組的表達量，以此表示假手術組及藥物干預組的目的基因相對表達量與模型組的差別。

1.2.6GDF-15、Smad2蛋白表達測定 造模后24 h，1.5%戊巴比妥麻醉處死大鼠，取大腦組織于蛋白裂解緩沖液中勻漿,分離提取各個大鼠大腦總蛋白。總蛋白濃度測定符合要求后，蛋白于SDS-PAGE 膠上進行電泳分離并轉膜。5%脫脂牛奶封閉，于4℃搖床中一抗(1∶1 000)孵育過夜，PBS洗膜3次，二抗(1∶5 000) 孵育1.5 h，PBS洗膜3次，ECL化學發光試劑盒顯像。利用化學發光熒光成像儀的MI軟件中的圖像分析功能對條帶灰度進行分析，計算目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值作為半定量結果。

1.2.7蘇木素-伊紅(HE)染色 造模24 h后，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉致死，取大腦視交叉前后2 mm冠狀切片組織塊置于10%甲醛溶液中固定，進行常規石蠟切片，厚度為4 μm，HE染色，中性樹膠封片后于LEICA DMLB型光學顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態學變化。

2 結果

2.1依達拉奉對MCAO大鼠神經行為的影響 與假手術組比較，模型組大鼠神經行為評分在缺血4、10、24 h均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉低、高劑量組大鼠在缺血4、10、24 h神經行為評分均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2依達拉奉對MCAO大鼠大腦梗死面積的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，依達拉奉低、高劑量組大鼠腦梗死面積顯著減少(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3依達拉奉對MCAO大鼠大腦GDF-15 和Smad2 mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠大腦GDF-15 和Smad2 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，依達拉奉低、高劑量組大鼠大腦GDF-15 和Smad2 mRNA的表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖2。

表1 依達拉奉對MCAO大鼠神經行為的影響
Tab.1 Effect of edaravone on neurobehaviour in MCAO rats

GroupsDose(mg/kg)nNeuro-behaviour4h10h24hSham-operatedgroup-12000Modelgroup-128.60±0.881)8.00±0.971)7.60±1.151)Lowdosegroupofedaravane1.5124.90±1.062)4.50±1.352)4.30±0.882)Highdosegroupofedaravane3123.70±1.073)3.10±1.583)2.80±0.823)

Note：Compared with sham-operated group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表2 依達拉奉對MCAO大鼠大腦梗死面積的影響
Tab.2 Effect of edaravone on cerebral infarct size in MCAO rats

GroupsDose(mg/kg)nCerebarlinfarctsize(%)Sham-operatedgroup-60Modelgroup-635.44±4.211)Lowdosegroupofedaravane1.5628.25±8.802)Highdosegroupofedaravane3624.49±5.273)

Note：Compared with sham-operated group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖1 各組大鼠大腦的梗死面積Fig.1 Infarct size of rat brain in each groupNote:A.Sham operation group；B.Model group；C.Edaravone low dose group；D.Edaravone high dose group.

圖2 各組大鼠大腦的GDF-15 和Smad2 mRNA表達水平Fig.2 Expression levels of GDF-15 and Smad2 in brain of rats in each groupNote:1.Sham operated group;2.Model group;3.Low dose group of edaravane；4.High dose group of edaravane.Compared with sham-operated group,#.P<0.05,##.P<0.01;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖3 各組大鼠大腦GDF-15和Smad2的蛋白表達條帶與其統計Fig.3 HE staining results of rat brain in each groupNote:1.Sham-operation group；2.Model group；3.Low dose of edaravone group；4.High dose of edaravone group.Compared with sham-operartion group，##.P<0.01;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 各組大鼠大腦HE染色結果Fig.4 Protein bands of GDF-15 and Smad2 in brain of rats in each group and their statistical mapsNote:A.Sham-operation group;B.Model group;C.Low dose group of edaravane;D.High dose group of edaravane.

2.4依達拉奉對MCAO大鼠大腦GDF-15 和Smad2 蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠大腦GDF-15 和Smad2的蛋白表達水平明顯升高；與模型組比較，依達拉奉低、高劑量組大鼠大腦GDF-15和Smad2蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖3。

2.5依達拉奉對MCAO大鼠大腦組織病理形態學的影響 圖4結果顯示，假手術組腦組織未見結構異常。模型組各個大鼠大腦皮質均見有缺血區病灶、淡染、組織結構紊亂；大腦白質結構破壞；腦組織充血、水腫。部分樣本見神經組織壞死、液化形成的圓形或卵圓形、邊界清楚的鏤空篩網狀軟化灶，腦皮質神經元胞體縮小、尼氏小體消失、細胞間隙增寬。依達拉奉低、高劑量組，大腦皮質亦見有缺血區病灶，淡染，組織結構紊亂程度較模型組有改善，部分樣本均見大腦白質結構破壞；樣本也觀察到神經組織壞死、大腦皮質神經元胞體縮小、細胞間隙增寬等情況。病變程度較模型組輕。依達拉奉高劑量組病變程度較模型組及低劑量組輕。

3 討論

急性腦梗死，包括缺血性和出血性腦梗死，都有著極高的致殘率和致死率[1]。依達拉奉是日本三菱制藥有限公司開發的自由基清除劑，并于2001年上市[2,10]。由于依達拉奉低脂溶性高，容易通過血腦屏障到達腦組織，因此對于腦缺血后的腦神經組織具有強大的保護作用，作為一種有效的腦神經保護劑廣泛應用于臨床[11]。目前研究發現其機制主要是清除自由基、降低脂質過氧化，并能調控細胞凋亡相關基因的表達，保護腦細胞、血管內皮等免受過氧化損傷[11-14]。腦梗死后可誘發MAPK信號轉導通路的激活，JNK磷酸化程度升高，使得神經元損傷加重，依達拉奉的治療可明顯抑制MAPK通路 JNK的表達，減輕氧化應激后神經元的損傷[15]。出血事件通常會引起血腦屏障的損傷，基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMPs)大量增加，而MMP-9的大量增加會進一步加劇神經元損傷、凋亡及血腦屏障受損，依達拉奉干預后，可使血清中MMP-9的含量明顯降低，使得缺血性腦梗死后的血腦屏障受損程度降低[16]。

GDF-15是TGF-β細胞因子超家族的一個成員，廣泛表達于各組織中，被認為是心血管生理病理過程的獨立生化標記物，其含量的大量升高可反映冠心病、急性腦梗死、心肌梗死等嚴重病變的發生[17]。多項研究表明，隨著急性腦梗死病情的加重，GDF-15的表達水平顯著升高，大量的GDF-15浸潤病變組織相關的神經元，使神經元受損[6，18]。此外，GDF-15參與腦梗死后大腦的應激反應，使得炎癥反應加劇[18]。從多方面看，降低腦梗死后GDF-15的表達水平對腦神經組織的保護有著十分重要的意義。本研究針對這個方面，研究依達拉奉對急性腦梗死腦神經損傷的保護機制是否與GDF-15表達的調控有關。結果顯示大鼠MCAO造模后，大腦中切片可見明顯的梗死區，且神經行為學評分明顯升高，腦組織病變程度嚴重，可見造模成功，而該MCAO大鼠大腦中GDF-15及其下游信號分子Smad2的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，該結果與目前報道的結果一致。當機體受到損傷時，受損區域會釋放TGF-β，其與細胞表面的受體結合可正反饋促使TGF-β磷酸化，該效應會激活Smad通路，而Smad通路也受GDF-15調節，有研究顯示急性腦梗死后Smad2的表達水平明顯升高[19]。給予不同劑量的依達拉奉干預后，大鼠神經行為學評分明顯下降，腦梗死面積明顯減少，且腦組織病變程度大大減輕，同時，腦組織中GDF-15及其下游信號分子Smad2的mRNA及蛋白表達水平明顯下降，且以3 mg/kg劑量更為明顯。該結果可能與腦梗死后使用依達拉奉的治療時間有關，有研究顯示在急性腦梗死后1～3 h使用依達拉奉的腦神經保護作用較好，而依達拉奉靜脈給藥劑量達到3 mg/kg能有較顯著的療效[8]。

依達拉奉臨床應用有十多年，而其作用機制仍有很大的研究空間。明確的作用機制對于臨床藥物應用有十分重要的意義，本研究為依達拉奉臨床治療急性腦梗死的治療機制提供科學依據，依達拉奉或可用于其他GDF-15升高的病變治療，但仍需更多的證據支持。