葛花解酲方對乙醇性HBV轉基因小鼠肝癌前病變GST-Pi和PCNA表達及Wnt/β-catenin信號通路的影響①

吳文宇 楊 柱 龍奉璽 羅 莉 魏顯鰻 稅會利 唐東昕

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科,貴陽 550001)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，肝癌的發病率和死亡率均比較高，對人類健康造成嚴重危害，有效防治肝癌的發生發展是臨床工作中面臨的艱巨而緊迫的問題。肝癌起病隱匿，預后差，肝癌的發生經歷了慢性肝炎、肝硬化、肝癌前病變、肝癌等漫長的病情發展過程，肝硬化是肝癌的獨立危險因素。肝癌前病變的形態學特征為異型增生結節，異型增生結節為肝硬化結節發展的結果，是肝癌啟動、促進、演變過程的中間環節，阻斷肝硬化結節向肝異型增生結節發展是阻斷肝癌的理想時機[1]。葛花解酲方由豆蔻仁、葛花、砂仁、炒神曲、白術、干姜、澤瀉、茯苓、豬苓、橘皮、人參、木香、青皮組成，具有分消酒濕、溫中健脾、消補兼施的功效，在治療酒精性肝病中具有良好效果，研究發現葛花解酲方對肝癌的發生發展也有阻止作用[2，3]，但其機制尚不完全清楚。GST-Pi在癌前階段已開始表達，是肝癌的早期診斷指標[4，5]；PCNA為細胞核增殖相關抗原，可作為增殖期的標志物[6]；Wnt/β-catenin信號通路在惡性腫瘤的生長、凋亡等過程中發揮中藥作用，參與惡性腫瘤的增殖過程[7，8]。本文通過對葛花解酲方對乙醇性HBV轉基因小鼠肝癌前病變GST-Pi和PCNA表達及Wnt/β-catenin信號通路的影響進行研究，探討葛花解酲方逆轉肝癌前病變的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性、6～8周齡、體重20～24 g、HBV轉基因小鼠100只，購自中國人民解放軍第458醫院全軍肝病中心，許可證號：SCXK(軍)2012-0018。

1.1.2實驗用藥 豆蔻仁15 g，葛花15 g，砂仁15 g，炒神曲6 g，白術6 g，干姜6 g，澤瀉6 g，茯苓4.5 g，豬苓4.5 g，橘皮4.5 g，人參4.5 g，木香1.5 g，青皮0.9 g，所有藥材購自北京同仁堂大藥房，按照藥方配方制成濃度為4 g/ml水煎劑備用。

1.1.3主要試劑 紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司)，免疫組化染色試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、HE染色試劑盒(美國Sigma公司)，兔抗鼠GST-Pi單克隆抗體、兔抗鼠PCNA單克隆抗體、兔抗鼠Wnt-1多克隆抗體、兔抗鼠β-catenin多克隆抗體等抗體(英國Abcam公司)等。

1.2方法

1.2.1動物分組 將100只小鼠根據隨機數字法分為對照組、模型組、葛花解酲方組和葛花解酲方+LiCl組，每組25只。

1.2.2建立肝癌癌前病變小鼠模型 將模型組、葛花解酲方組和葛花解酲方+LiCl組小鼠給予53%(v/v)紅星二鍋頭灌胃，10 ml/(kg·d)，每天灌胃1次，對照組小鼠每天等量生理鹽水灌胃，共20周。

1.2.3各組小鼠處理 葛花解酲方組和葛花解酲方+LiCl組小鼠在每天紅星二鍋頭灌胃前30 min給予葛花解酲方水煎劑(40 g/kg)灌胃，每天1次；對照組和模型組每天給予等量生理鹽水灌胃；葛花解酲方+LiCl組小鼠在葛花解酲方灌胃前30 min給予LiCl[1 mEq/(kg·d)]灌胃[9]，每天1次，其他三組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。共20周。

1.2.4標本采集及處理 20周結束時，每組取10只小鼠脫臼處死，立即取小鼠肝臟用于測定肝臟重量、肝臟指數和Western blot檢查；每組另取10只小鼠，脫臼處死后取肝臟組織于多聚甲醛中固定24 h，用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.5肝臟重量和肝臟指數測定 將10只小鼠處死前稱重，處死后立即取肝臟組織稱重，計算各小鼠肝臟指數，肝臟指數=肝臟重量/小鼠體重(mg/g)。

1.2.6HE染色觀察肝臟病理學變化 石蠟包埋多聚甲醛固定的肝臟組織，切成5 μm切片，經脫蠟至水，蘇木素染色5 min，乙醇分色5 s，氨水返藍20 s，伊紅染色3 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.7免疫組化染色測定肝臟GST-Pi和PCNA表達 將石蠟切片置入烤箱中烤片1 h，經脫蠟至水，放入枸櫞酸鈉緩沖液中修復10 min，加入過氧化氫封閉10 min消除內源性過氧化物酶的活性，加入抗原封閉液封閉30 min，加入一抗：兔抗鼠GST-Pi單克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠PCNA單克隆抗體(1∶200)過夜孵育，加入抗兔二抗孵育30 min，DAB顯色10 min，蘇木素復染，二甲苯透明、中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替。細胞核或細胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性，GST-Pi主要分布在肝細胞漿中，PCNA主要分布在肝細胞核中。每張切片拍攝5個高倍視野(400倍)，采用Image-Pro-plus6.0圖像分析軟件測定GST-Pi和PCNA的積分光密度(IOD)。

1.2.8Western blot測定肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平 將肝臟組織勻漿，提取肝組織總蛋白，采用BCA測定肝組織蛋白濃度和含量，每孔上樣量20 μg，進行轉膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗：兔抗鼠Wnt-1多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠β-catenin多克隆抗體(1∶1 000)過夜孵育，以β-actin為內參照，加入二抗孵育1 h，顯色液顯色，采用Quantity One軟件分析條帶亮度，肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平以Wnt-1、β-catenin條帶灰度值/β-actenin條帶灰度值表示。

2 結果

2.1各組小鼠肝臟重量、肝臟指數比較 與對照組比較，模型組小鼠肝臟重量和肝臟指數升高(P<0.05)；與模型組比較， 葛花解酲方組小鼠肝臟重量和肝臟指數降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟重量和肝臟指數升高(P<0.05)。見表1。

GroupsnLiverweight(g)Liverindex(mg/g)Controlgroup101.358±0.02345.21±1.34Modelgroup101.542±0.0191)60.47±1.421)GehuaJiechenggroup101.411±0.0211)2)49.53±1.461)2)GehuaJiecheng+LiClgroup101.478±0.0221)2)3)54.37±1.391)2)3)F141.067218.290P0.0000.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05；compared with the Model group,2)P<0.05；compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

2.2各組小鼠肝臟HE染色情況 對照組小鼠肝臟結構和形態正常，有完整的匯管區和肝小葉；模型組小鼠肝細胞變質和結節性增生明顯，可見典型的假小葉，肝細胞變質主要為小滴質變、水腫、點狀壞死，增生肝細胞體積增大、核染色深，炎癥細胞浸潤、纖維增生和膽管異常增生明顯，膽管上皮增生并具有異型性；葛花解酲方組小鼠肝細胞變質、結節性增生、炎癥細胞浸潤、膽管上皮增生及異型性較輕；葛花解酲方+LiCl組小鼠肝細胞變質、結節性增生、炎癥細胞浸潤、膽管上皮增生及異型性介于模型組和葛花解酲方組之間。見圖1。

2.3各組小鼠肝臟GST-Pi表達比較 與對照組比較，模型組小鼠肝臟GST-Pi IDO升高(P<0.05)；與模型組比較，葛花解酲方組小鼠肝臟GST-Pi IDO降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟GST-Pi IDO升高(P<0.05)。見表2和圖2。

2.4各組小鼠肝臟PCNA表達比較 與對照組比較，模型組小鼠肝臟PCNA IDO升高(P<0.05)；與模型組比較，葛花解酲方組小鼠肝臟PCNA IDO降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟PCNA IDO升高(P<0.05)。見表3和圖3。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色(×100)Fig.1 HE staining of liver in each group of mice(×100)Note:A.Control group；B.Model group；C.Gehua Jiecheng；D.Gehua Jiecheng+LiCl group.

GroupsnGST-PiIDOControlgroup102135.42±1053.26Modelgroup1094724.53±1215.461)GehuaJiechenggroup10 4728.57±1164.381)2)GehuaJiecheng+LiClgroup10 6908.46±1179.321)2)3)F15261.374P0.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05；compared with the Model group,2)P<0.05；compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

圖2 各組小鼠肝臟GST-Pi免疫組化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of liver GST-Pi in each group of mice(×400)Note:A.Control group；B.Model group；C.Gehua Jiecheng；D.Gehua Jiecheng+LiCl group.

GroupsnPCNAIDOControlgroup10483.14±142.15Modelgroup1021424.15±1861.321)GehuaJiechenggroup10 3152.15±1253.161)2)GehuaJiecheng+LiClgroup10 7463.17±1574.381)2)3)F460.914P0.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05;compared with the Model group,2)P<0.05;compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

圖3 各組小鼠肝臟PCNA IDO免疫組化染色(×400)Fig.3 Immunohistochemical staining of PCNA IDO in liver of each group of mice(×400)Note:A.Control group；B.Model group；C.Gehua Jiecheng；D.Gehua Jiecheng+LiCl group.

GroupsnWnt-1β-cateninControlgroup100.08±0.020.07±0.03Modelgroup100.82±0.111)0.64±0.091)GehuaJiechenggroup100.17±0.051)2)0.15±0.041)2)GehuaJiecheng+LiClgroup100.29±0.061)2)3)0.31±0.051)2)3)F236.129194.275P0.0000.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05;compared with the Model group,2)P<0.05;compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

圖4 各組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白Western blot電泳圖Fig.4 Western blot analysis of Wnt-1 and β-catenin proteins in liver tissues of mice in each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Gehua Jiecheng group;4.Gehua Jiecheng+LiCl group.

2.5各組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平比較 與對照組比較，模型組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，葛花解酲方組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)。見表4和圖4。

3 討論

肝癌前病變的發生是一個復雜而緩慢的過程，癌前病變是癌癥啟動、促進和演變的中間階段，僅有少量細胞在特定條件下發生癌變，因此癌前病變過程是可逆的，是癌癥防治的重點。HBV感染可促進肝癌的發生發展，我國大部分肝癌由HBV感染進一步發展而來；我國酒精性肝損傷是繼肝炎后的第二大肝損傷原因。慢性肝病經過癌前病變演變為肝癌是多步驟多階段的過程，其中細胞失控性生長是惡性惡性腫瘤發生的生物學特征,細胞失控性生長的主要分子機制為細胞增殖過度以及細胞凋亡減少[10]。GST-Pi是谷胱甘肽S-轉移酶家族成員之一，是細胞抗癌變的重要解毒系統[11]，在多種惡性腫瘤中表達，在癌前狀態中表達升高，是癌癥啟動細胞最早和最準確的標志酶，其表達數量和癌細胞的增殖多少關系密切[12,13]。PCNA和DNA合成關系密切，是DNA聚合酶輔助蛋白，在DNA復制的調節中發揮重要作用[14]；在細胞增殖后期G1期PCNA表達升高，在G1/S期交界時其表達達高峰，和細胞增殖關系密切[15]；在增殖活性旺盛的腫瘤細胞中表達升高，和惡性腫瘤的發生發展關系密切[16,17]。本研究通過建立乙醇性HBV轉基因小鼠肝癌前病變模型，發現乙醇性HBV轉基因肝癌前病變小鼠中，肝臟重量、肝臟指數升高，肝細胞變質和結節性增生明顯，可見典型的假小葉，炎癥細胞浸潤明顯，膽管上皮增生并具有異型性，表明肝癌前病變小鼠模型建立成功；小鼠肝臟組織中GST-Pi和PCNA表達量升高，GST-Pi和PCNA表達量與癌前病變細胞增殖關系密切，表明肝癌前病變小鼠肝臟細胞存在異常增殖。

中醫無肝癌前病變之說，根據肝癌前病變的病因病機，考慮類似于“肋痛”、“黃疸”、“積聚”、“臌脹”等范疇。肝癌前病變由多種致病因素共同作用的結果，病因包括：①內因：陰陽氣血虧虛、臟腑經絡失調；②外因：傷食、六淫等邪毒郁積，從而導致邪毒縮聚成塊，形成癌瘤。葛花解酲方來自李東垣的《脾胃論》，具有減少肝細胞破壞、穩定肝細胞、調節細胞因子水平、減輕肝損傷；減輕肝細胞變性壞死等作用，是治療酒精性肝病的良方。近來研究發現葛花解酲方對肝癌具有保護作用，如王鏡輝等[18]研究發現葛花解酲方通過抑制端粒酶蛋白表達、抑制細胞增殖對小鼠肝癌原位移植瘤發揮防治作用；李軍等[19]發現葛花解酲方可通過調節外周血中免疫炎癥因子含量改善小鼠的免疫功能，從而抑制小鼠移植性肝癌的生長；郭斌等[20]發現葛花解酲方可通過調控細胞周期調控因子的表達逆轉肝癌癌前病變的發生，發揮肝臟保護作用。本文對肝癌前病變小鼠給予葛花解酲方處理，發現經葛花解酲方處理小鼠肝臟重量、肝臟指數、GST-Pi IDO、PCNA IDO降低；肝細胞變質、結節性增生、炎癥細胞浸潤、膽管上皮增生及異型性較輕。表明葛花解酲方可逆轉乙醇性HBV轉基因小鼠肝癌前病變，其機制可能與葛花解酲方可降低GST-Pi和PCNA表達、抑制肝組織細胞增殖有關。

Wnt信號通路為一條多作用位點、多環節的開放通路，在細胞增殖、細胞分化和細胞凋亡中發揮重要作用，Wnt/β-catenin信號通路為典型的Wnt通路[21,22]；β-catenin為多功能細胞漿蛋白，其在機體處于疾病狀態下，因體內環境的改變，游離的β-catenin進入細胞核，調節相關基因的表達，參與細胞的增殖過程[23-25]。如RARα敲低通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制其下游靶標PCNA、Ki67、MMP7和MMP9的表達抑制食道癌的增殖和轉移[26]；姜黃素通過抑制Wnt/β-catenin途徑抑制其下游細胞周期蛋白D1和PCNA的表達[27]。上述研究表明通過抑制Wnt/β-catenin信號通路可抑制惡性腫瘤細胞的增殖，且PCNA為Wnt/β-catenin信號通路的下游基因，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路可抑制其下游PCNA等細胞增殖相關因子，從而發揮抑制細胞增殖的作用。本文研究發現肝癌前病變小鼠肝組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平升高，給予葛花解酲方處理后肝組織Wnt-1、β-catenin蛋白水平降低，在給予葛花解酲方處理的同時給予Wnt/β-catenin信號通路激動劑干預，則小鼠肝臟重量、肝臟指數、GST-Pi IDO、PCNA IDO、Wnt-1和β-catenin蛋白升高，可見Wnt/β-catenin信號通路激動劑對葛花解酲方對肝癌前病變的逆轉有阻止作用，表明葛花解酲方可能通過Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌前病變的進展。

綜上所述，葛花解酲方可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低肝組織GST-Pi和PCNA表達，從而抑制肝細胞增殖、逆轉肝癌前病變過程。