慢病毒介導NFAT基因對HepG2細胞生物學行為的影響①

許 洋 張雅敏 王 建 楊 龍 劉子榮 (天津市第一中心醫院器官移植中心，天津 300192)

活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)最初作為與人T細胞中IL-2啟動子的抗原受體應答元件-2(ARRE-2)相結合的誘導型核因子被發現[1]。NFAT家族包括5名成員：NFATc1(也稱NFAT2)、NFATc2(NFAT1)、NFATc3(NFAT4)、NFATc4(NFAT3)和NFAT5，當細胞受到信號刺激時，通過鈣離子/鈣調蛋白激酶信號通路，使 NFAT 蛋白迅速去磷酸化，進入細胞核內，與 NFAT 靶基因上的位點結合發揮其介導的基因轉錄調節功能。NFAT信號傳導的失調與腫瘤惡性表型和腫瘤進展有關，其已顯示出在調節腫瘤的發生發展，細胞的增殖、分化、侵襲、轉移、血管形成和腫瘤微環境中起到的重要作用[2]。血管內皮生長因子A(VEGFA)作為血管生成刺激因子，在血管生成的調節中起重要作用，是血管系統發育和分化所必需的，當它與血管內皮生長因子受體(VEGFR)結合后，會使眾多通道上游和下游信號形成級聯，最終增強內皮細胞周圍組織的增殖、遷移、通透和滲透能力。然而NFAT在肝癌中的作用并沒有明確，并且在肝癌中NFAT與VEGFA的關系不清楚，為進一步探索NFAT蛋白與肝癌發生發展及其惡性特征的關系，本實驗將利用shRNA干擾技術，觀察干擾NFAT基因對于人肝癌HepG2細胞生長增殖、細胞侵襲遷徙及對VEGFA分子表達的影響，進一步揭示 NFAT 相關通路與臨床肝癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝細胞癌細胞系HepG2購自北京協和細胞中心，DMEM高糖液體培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，兔抗人NFAT多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購自英國Abcam公司，羊抗兔IgG—HRP第二抗體購自武漢博士德公司，總RNA提取試劑Trizol、逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自大連TaKaRa公司(Cell counting kit-8)CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1shRNA載體慢病毒的合成 根據GenBank的人NFAT mRNA(NM_172390)編碼區序列，遵循設計原則，設計干擾病毒，并設置陰性對照，shRNA慢病毒表達載體構建工作由上海吉凱公司完成。序列如下：NFAT-shRNA101：5′-CcggcgGAATCCTGAAACTCAGAAACTCGAGTTTCTGAGTTTCAGGATT-CCGTTTTTg-3′，NFAT-shRNA102：5′-CcggAAGCCGAATTCTCTGGTGGTTCTCGAGAACCACCAGAGA-ATTCGGCTTTTTTTg-3′，NFAT-shRNA103：5′-CcggCTGCATGGCTACTTGGAGAATCTCGAGATTCTCCA-AGTAGCCATGCAGTTTTTg-3′，陰性對照(CON313)：5′-CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAACGTGA-CACGTTCGGAGAATTTTTg-3′，陰性對照分子序列與NFAT基因及靶細胞內其他基因無明顯同源性。

1.2.2細胞培養與轉染 細胞培養于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/L，37℃、5%CO2，孵箱內培養，選取對數生長期的細胞用0.25%的胰酶消化后，調整細胞濃度為1×105個/ml，接種至6孔板中，貼壁后遵循慢病毒轉染說明書，以MOI=10指數轉染六孔板中細胞，加人終濃度5 μg/ml的Polybrene，8～12 h根據細胞狀態更換新鮮完全培養基，72 h后應用熒光觀察及嘌呤霉素進行穩定株篩選，嘌呤霉素篩選13 d后藥物克隆(細胞群落)出現，用浸有0.25%胰酶的無菌棉簽將群落消化，轉移至25 cm培養瓶培養，得到穩定轉染細胞克隆。細胞分組：未處理的HepG2細胞為對照組，陰性對照慢病毒轉染的HepG2細胞為陰性對照組，3種干擾慢病毒轉染的HepG2細胞為干擾組。

1.2.3Real-time PCR檢測NFAT mRNA、VEGFA mRNA表達 收集各組細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌后用Trizol一步抽提法提取細胞總RNA，按照逆轉錄盒及實時定量PCR試劑盒說明進行逆轉錄及Real-time PCR反應，引物用設計軟件Primer premier5.0 設計，由蘇州金唯智公司合成。NFAT上游引物：5′-CTCACAGCGATCTATTGTTCC-3′，下游引物：5′-CCTTCAGGTTGTTTCTTTCC-3′，PCR產物265 bp；VEGFA上游引物：5′-GAAAGACAGATCACAGGTACAG-3′，下游引物：5′-TTCCAACAATGTGTCTCTTC-3′，PCR產物241 bp；β-actin上游引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′，PCR產物500 bp。PCR擴增條件：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環，通過2-ΔΔCt計算各組相對對照組表達量。

1.2.4Western blot檢測NFAT蛋白、VEGFA蛋白水平的表達 提取各組細胞蛋白并進行蛋白定量，將蛋白樣品和5× loading buffer按4∶1的比例混勻，置于沸水中加熱10 min，配制10%SDS-PAGE分離膠，配制濃縮膠，后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入NFAT一抗(1∶1 000)、VEGFA一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶5 000)4℃過夜，后以TBST洗脫，1∶3 000二抗封閉作用2 h，TBST洗脫，ECL顯影觀察結果。

1.2.5CCK-8檢測細胞增殖能力 調整各組細胞濃度為5×104ml-1，接種陰性對照組細胞(NC組)、對照組細胞(control)及干擾組細胞(shRNA)于96孔板中，每孔各100 μl，每組設置5個平行對照并設置不含細胞的空白對照，培養5 d，每天相同時間點進行檢測，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續培養2 h，檢測450 nm波長下OD值。

1.2.6Transwell 實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力 細胞饑餓24 h后，調整各組細胞濃度為5×104ml-1，以無血清DMEM培養基配制單細胞懸液，每個Transwell上室加入200 μl細胞懸液，下室加入650 μl含10%FBS血清的DMEM培養基，侵襲實驗于小室上層鋪Matrigel基質膠，遷徙實驗則不鋪膠。培養24 h后取出小室，棉簽擦干小室上層，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，沖洗干凈，在200倍視野下隨機選取5個視野拍照計數。

2 結果

2.1細胞轉染效率 陰性對照組及NFAT-shRNA(101-103)慢病毒轉染的HepG2細胞內可見綠色熒光。各組慢病毒轉染后轉染效率達80%以上，后以嘌呤霉素篩選穩定轉染單克隆細胞系，見圖1。

2.2Real-Time PCR檢測穩定細胞株中NFAT mRNA、VEGFA mRNA表達 結果顯示，陰性對照組與對照組之間差異無明顯統計學意義(P>0.05)，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102、NFAT-shRNA103干擾組中NFAT mRNA表達較對照組及陰性對照組降低，差異有統計學意義(P<0.01)，表明轉染攜帶表達載體的慢病毒后能有效沉默人肝癌HepG2細胞中NFAT的表達，其中shRNA103干擾效果最明顯，干擾效率最高，見圖2、3。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組HepG2細胞轉染效果Fig.1 Fluorescence microscopy was used to detected HepG2 cells transfected with each groupNote:A.NFAT-shRNA101；B.NFAT-shRNA102;C.NFAT-shRNA103；D.NFAT-NC.

圖2 HepG2各組細胞轉染后NFAT mRNA表達量Fig.2 HepG2 expression of NFAT mRNA after transfectedNote:NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

2.3Western blot檢測各組穩定細胞株中NFAT及VEGFA蛋白表達 結果顯示，陰性對照組與對照組蛋白水平表達無明顯差異，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102、NFAT-shRNA103 干擾組中NFAT蛋白表達水平較對照組及陰性對照組降低，其中shRNA103組蛋白幾乎不表達，表明其干擾效果最明顯，干擾效率最高。結果顯示，NFAT干擾組中VEGFA蛋白水平表達較對照組及陰性對照組降低，見圖4、5。

圖3 HepG2各組細胞轉染后VEGFA mRNA表達量Fig.3 HepG2 expression of VEGFA mRNA after transfectedNote:NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖4 Western blot檢測人肝癌HepG2細胞 NFAT蛋白表達Fig.4 Western blot analysis were used to detect NFAT expression in HepG2 cell linesNote:A.Control;B.Negative control;C.NFAT-shRNA101;D.NFAT-shRNA102;E.NFAT-shRNA103.*.P<0.05,vs NFAT-NC and Control;**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

2.4干擾NFAT基因后對HepG2細胞增殖能力的影響 陰性對照組與對照組對于細胞增殖的影響差異未見明顯統計學意義(P>0.05)，NFAT-shRNA組細胞增殖能力受到明顯抑制，與陰性對照組及對照組相比有明顯統計學意義(P<0.01)，表明干擾NFAT基因后，能有效抑制HepG2細胞的增殖，見圖6。

圖5 Western blot檢測人肝癌HepG2細胞VEGFA蛋白表達Fig.5 Western blot analysis were used to detect VEGFA expression in human HepG2 cell linesNote:A.Control;B.Negative control;C.NFAT-shRNA103.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖6 CCK-8檢測細胞增殖能力Fig.6 Determination of cell proliferation by CCK-8Note:*.P<0.05,vs NFAT-NC and Control.

圖7 Transwell檢測HepG2細胞侵襲能力Fig.7 Transwell assays of HepG2 cells invasion ability

2.5干擾NFAT基因對HepG2細胞遷徙及侵襲能力的影響 HepG2細胞遷徙實驗結果顯示，相對于對照組及陰性對照組，干擾組遷徙及侵襲數量減少，差異有統計學意義(P<0.01)，表明干擾NFAT基因后，能有效抑制HepG2細胞的遷徙及侵襲能力，見圖7～10。

圖8 各組HepG2細胞穿膜數Fig.8 Number of invasion of HepG2 cells in each groupNote:NFAT-NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖9 Transwell檢測細胞遷徙能力Fig.9 Transwell assays of HepG2 cells migration ability

圖10 各組HepG2細胞穿膜數Fig.10 Number of migration of HepG2 cells in each groupNote:NFAT-NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

3 討論

原發性肝癌作為全世界最常見的惡性腫瘤，其在惡性腫瘤的死因中位列第二位，僅2015年全球新發病人數約745 000人[3]。盡管目前的手術治療及相關藥物治療效果較過去有明顯提高，術后5年生存率可達50%～60%，但復發率也高達60%～70%，對于早期診斷、手術后高復發率、高轉移率及不良預后的問題仍亟待解決。因此，為了改善及提升原發性肝癌治療的預后，關鍵在于對肝癌發生機制中相關新型特異性及敏感性靶點的發現及研究。本課題組在前期的實驗中發現，FK506作為鈣調神經磷酸酶抑制劑，能抑制NFAT的轉錄活化，而且其能顯著抑制HepG2和HepG2.2.15細胞增殖，其抑制增殖作用隨劑量增加而增強，這提示 NFAT 可能為促癌基因，NFAT信號通路的激活與肝癌的發生有著密切的聯系，抑制NFAT信號通路可能會阻止肝癌的進展[4]。同時NFAT具有多向調節功能，其不僅在多種免疫細胞如T細胞、B細胞、NK細胞中有表達，在非免疫細胞中也存在普遍表達，并且在胚胎發育、器官生成中起到重要作用[5,6]。一些研究證實，在人類實體惡性腫瘤及血液惡性腫瘤中，NFAT均存在過表達現象，并且在惡性腫瘤的生長增殖、細胞侵襲遷徙、血管生成及轉移的調節中扮演重要角色[7,8]。

基因沉默技術常用到的為小干擾RNA(siRNA)，其為一個長20～25個核苷酸的雙股RNA，在生物學上有許多不同的用途，目前siRNA主要參與RNA干擾(RNAi)現象，以帶有專一性的方式調節目的基因的表達，對特定基因產生具有專一性的敲弱效果，基因沉默技術的發展為腫瘤基因靶向治療提供了新的途徑[9,10]。傳統的干擾基因方式為通過轉染siRNA的方法使之進入細胞內，參與到RNAi途徑，發揮使靶基因沉默的效應，這一方法受轉染效率的影響較大。本實驗采用含shRNA表達載體的慢病毒干擾目的基因，相對于siRNA瞬轉方式，其轉染細胞時，載體可以穩定地整合到基因組中，在細胞內轉錄生成shRNA,利用細胞內的Dicer酶，生成相應的siRNA，發揮RNAi作用，并且在細胞中脫靶效應要低于siRNA，其感染細胞效率高，干擾效果持久且穩定，后期經嘌呤霉素篩選出單克隆細胞株，形成穩定轉染細胞系。

為保證mRNA被有效抑制，本實驗針對不同靶點設計3種不同shRNA，在3種干擾病毒作用下，PCR及Western blot結果顯示，相對于對照組，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102及NFAT-shRNA 103組中NFAT mRNA及NFAT蛋白均明顯降低，HepG2細胞中NFAT基因受到抑制，根據結果，確定NFAT-shRNA103組為干擾效果最好，故后續實驗以其作為干擾組。同時，陰性對照組未見明顯抑制，表明shRNA抑制具有特異性。各組VEGFA的基因表達及蛋白表達結果表明，NFAT對于VEGFA的表達有促進作用，其很可能作為NFAT下游的靶蛋白而發揮作用。Wang等[11]發現在HepG2細胞中激活鈣調神經磷酸酶/NFAT通路后，腫瘤細胞的侵襲及增殖能力大大增強。Chen等[12]發現當使用siRNA沉默細胞內VEGFA基因表達時，其Transwell結果顯示侵襲實驗及遷徙實驗中細胞穿膜數均較對照組明顯減少，且細胞增殖能力明顯減弱。本實驗中CCK-8及Transwell實驗證明干擾NFAT基因，VEGFA基因及蛋白表達量明顯減弱，細胞增殖活性、侵襲及遷徙能力顯著降低，這些結果表明NFAT可能為其生物學行為改變的重要基因，激活的NFAT蛋白可能激活下游VEGFA基因，促進VEGFA蛋白轉錄活化，增強了腫瘤細胞侵襲及增殖能力，而干擾NFAT的表達后，其生物學惡性行為明顯減弱。Müller等[13]發現VEGF由內皮細胞、成纖維細胞及腫瘤細胞分泌，其與內皮細胞上相關受體(VEGFAR)結合后，引起PLCγ的激活，從而引起鈣內流而使NFAT蛋白轉錄活化，而激活的NFAT蛋白又促進了VEGFA及VEGFAR的合成從而形成瀑布式效應。所以激活NFAT通路后VEGFA及其受體會持續轉錄活化，促進細胞生長增殖、侵襲及遷徙能力。

綜上所述，NFAT蛋白在肝癌的發生發展中起到重要作用，活化的NFAT蛋白可能通過級聯作用激活下游的VEGFA因子，從而增強細胞的生物學功能。通過使用靶向NFAT的shRNA載體轉染后，不僅抑制NFAT在細胞內的水平，還特異性抑制其生物學行為，提示NFAT可作為肝癌基因治療的潛在靶點，為臨床肝癌的診斷及治療提供新思路。此外，抑制過表達NFAT基因導致細胞增殖、侵襲及遷徙能力改變是否完全依賴于VEGFA的作用，是否存在其他下游靶點的激活或抑制，其作用機制還有待進一步研究。