miRNA27a靶向GOLM1對非小細胞肺癌生物行為學(xué)的影響①

鄭 興 吳兆紅 陳崗東 王戈菲 潘有光 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心胸外科，廣州 510150)

肺癌是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率在所有類型的惡性腫瘤中高居榜首，5年生存率僅為15%左右[1]。肺癌的主要病理類型為小細胞肺癌(small lung cancer，SLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小細胞肺癌約占總發(fā)病率的85%[2]。非小細胞肺癌發(fā)病隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此對其發(fā)病機制的研究已成為非小細胞肺癌早期診斷和臨床治療的重中之重。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于動植物中的一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，全長約為18～25個核苷酸，主要通過互補配對的形式與其靶基因的3′非編碼區(qū)結(jié)合，進而誘導(dǎo)靶基因的降解或抑制靶基因的翻譯[3]。研究顯示，miR-27a在乳腺癌、胃癌、腎癌、肝癌、食管癌等多種惡性腫瘤中表達異常，并密切參與腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡等病理生理過程[4,5]。本研究旨在探究miR-27a在非小細胞肺癌中的生物學(xué)功能及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549購自上海中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，30只SPF級，7周齡，體重(20～22)g的BALB/c雄性裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司。plenti-GFP空載和plenti-GFP-miR-27a慢病毒載體由上海吉瑪制藥技術(shù)公司構(gòu)建，GOLM1-WT和GOLM1-Mut熒光素酶報告載體由深圳市盎然生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。PEG8000、嘌呤霉素均購自上海生工生物工程有限公司。GOLM1兔單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自英國Abcam公司，Dual-Luciferase?Reporter Assay System熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。Transwell細胞小室購自美國Corning公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1miR-27a慢病毒包裝及穩(wěn)定細胞系構(gòu)建 plenti-GFP空載或plenti-GFP-miR-27a慢病毒載體分別與包裝質(zhì)粒pMD2.0G和pAXAS2共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染48 h、60 h、72 h時分別收集細胞上清病毒溶液。將收集所得病毒溶液合并，將病毒上清與PEG8000以30∶7.5的比例進行混合，4℃靜置過夜。4 000 g離心20 min，棄上清，病毒沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸。隨后將病毒加入到對數(shù)生長期的人非小細胞肺癌細胞A549中，感染48 h后，用1 μg/ml的嘌呤霉素篩選未感染細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況，待細胞全部表達綠色熒光時表明慢病毒穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功。構(gòu)建成功細胞系分別為miR-27a NC組和miR-27a OE組。

1.2.2熒光素酶分析miR-27a與GOLM1靶向關(guān)系 根據(jù)miRNA生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測miR-27a可能的靶基因為GOLM1，并分析miR-27a與GOLM1之間的作用片段序列。設(shè)計野生型GOLM1-3′-UTR(GOLM1-WT)及缺失miR-27a結(jié)合區(qū)域的突變體GOLM1-3′-UTR(GOLM1-Mut)序列，并構(gòu)建熒光素酶報告載體。將GOLM1-WT和GOLM1-Mut分別轉(zhuǎn)染miR-27a NC和miR-27a OE細胞系，48 h后采用熒光素酶雙報告基因檢測試劑盒測定細胞熒光素酶活性，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3Western blot檢測GOLM1蛋白表達水平 收集miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對數(shù)生長期A549細胞1×106個，加入100 μl 1×SDS Loading buffer，沸水浴中煮沸10 min，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入用封閉液稀釋的GOLM1兔單克隆抗體(1∶5 000),4℃孵育過夜。次日PBST洗滌6 min，重復(fù)3次，然后加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育60 min，PBST洗滌6 min，重復(fù)3次，ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖活力 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對數(shù)生長期A549細胞用胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×105個/ml，以每孔100 μl的量接種于96孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)12 h至細胞貼壁。每孔分別于24、36、48和72 h時加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在450 nm處測定各孔吸光度值。每組細胞每個時間點均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.5Transwell檢測細胞侵襲能力 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對數(shù)生長期A549細胞用胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×105個/ml，以每孔100 μl細胞懸液接種于Transwell上室，下室加入500 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，PBS漂洗2次，多聚甲醛固定20 min，用棉簽輕輕擦掉上室未侵襲的細胞。結(jié)晶紫染色5 min，自來水沖洗結(jié)晶紫染料，適當(dāng)風(fēng)干Transwel膜，顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野，統(tǒng)計并分析兩組細胞的侵襲個數(shù)。

1.2.6TUNEL檢測細胞凋亡情況 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對數(shù)生長期A549細胞用胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×105個/ml，以每孔100 μl細胞懸液接種于96孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。PBS洗滌1次，用含0.3%TritonX-100的PBS室溫孵育5 min，PBS洗滌2次，加入50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.7體內(nèi)移植瘤實驗分析小鼠體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移情況 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對數(shù)生長期A549細胞重懸于PBS并調(diào)整濃度至5×107個/ml，取100 μl細胞懸液接種于BALB/c裸鼠腋下脂肪墊，于SPF級動物房內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察并記錄各組小鼠皮下腫瘤的生長狀況，32 d后處死小鼠并解剖腹腔，顯微鏡下觀察腹膜內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。腫瘤體積(V)= 0.52×長×寬2。

2 結(jié)果

2.1miR-27a與GOLM1靶向關(guān)系的驗證 通過生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件分析miR-27a可能的作用靶點為GOLM1，miR-27a與GOLM1 mRNA 3′UTR區(qū)的互補序列見圖1A。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染GOLM1-WT的miR-27a NC組細胞相比，轉(zhuǎn)染GOLM1-WT的miR-27a OE組細胞的熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染GOLM1-Mut后的miR-27a NC組和miR-27a OE組細胞的熒光素酶相對活性無顯著性差異(P>0.05)，見圖1B。表明GOLM1是miR-27a的作用靶點。

圖1 miR-27a與GOLM1靶向關(guān)系的驗證Fig.1 Verification of miR-27a and GOLM1 targeting relationshipNote:Compared with the miR-27a NC group in GOLM1-WT,*.P<0.05.

2.2miR-27a過表達對GOLM1蛋白水平的影響 Control組、miR-27a NC組和miR-27a OE組細胞的GOLM1蛋白相對表達水平分別為1.35±0.08、1.31±0.09和0.54±0.05。與Control組和miR-27a NC組相比，miR-27a OE組細胞GOLM1的蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Control組和miR-27a NC組細胞GOLM1的蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)，見圖2。表明miR-27a可負向調(diào)控GOLM1的表達。

圖2 miR-27a過表達對GOLM1蛋白水平的影響Fig.2 Effect of miR-27a overexpression on GOLM1 protein

2.3miR-27a 對A549細胞增殖活力的影響 與Control組和miR-27a NC組相比，在24、36、48和72 h四個時間段miR-27a OE組細胞的增殖活力均受到顯著的抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Control組和miR-27a NC組細胞增殖活力差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 miR-27a 過表達對A549細胞增殖活力的影響Fig.3 Effect of miR-27a overexpression on proliferation of A549 cells

2.4miR-27a對A549細胞侵襲能力的影響 為了進一步評估m(xù)iR-27a對A549體外轉(zhuǎn)移的影響，采用Transwell檢測A549過表達miR-27a后細胞侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，與Control組(80.26±8.03)個和miR-27a NC組(77.51±10.18)個相比，miR-27a OE組(39.66±5.74)細胞的侵襲能力受到顯著的抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 miR-27a 過表達對A549細胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-27a overexpression on invasive ability of A549 cells

2.5miR-27a過表達對A549細胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與Control組(49.17±6.56)個和miR-27a NC組(44.84±7.01)個相比，miR-27a OE組(82.49±9.70)個細胞凋亡數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 miR-27a 過表達對A549細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-27a overexpression on apoptosis of A549 cells

2.6miR-27a 過表達對裸鼠皮下移植瘤的影響 裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，miR-27a OE組腫瘤生長速度顯著低于Control組和miR-27a NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-27a OE組小鼠體內(nèi)成瘤后腹膜內(nèi)的轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量(8.85±1.57)也顯著低于Control組(14.25±3.04)和miR-27a NC組(14.69±2.73)小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 裸鼠皮下移植瘤體積比較Fig.6 Comparison of subcutaneous transplantation tumor volume

3 討論

高爾基體膜蛋白(golgi membrance protein 1，GOLM1)又稱GOLPH2和GP73，是一種定位于高爾基體順面囊膜的Ⅱ型高爾基體膜糖蛋白[6]。GOLM1的表達具有上皮細胞特異性，在膽管、肝、腎、腸、前列腺等上皮細胞中發(fā)揮多種功能，是維系正常細胞功能和內(nèi)臟器官生長發(fā)育的重要蛋白[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)GOLM1在肝癌、腎癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達，并與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9,10]。最新的研究表明GOLM1在非小細胞肺癌中高表達，密切參與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與患者的不良特征密切相關(guān)[11-13]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GOLM1的3′UTR區(qū)存在miR-27a的多個堿基結(jié)合位點，可能是miR-27a的作用靶點，因此我們采用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了GOLM1是miR-27a的下游靶基因，提示miR-27a可能通過靶向GOLM1的mRNA進而調(diào)控其蛋白表達。Western blot結(jié)果進一步顯示過表達miR-27a可顯著下調(diào)GOLM1的蛋白表達水平。綜合以上結(jié)果，我們推測miR-27a靶向調(diào)控GOLM1基因可能在非小細胞肺癌的發(fā)生于發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

研究顯示miR-27a在乳腺癌、食管癌、惡性膠質(zhì)瘤、肝癌等不同惡性腫瘤中可與多個靶基因結(jié)合從而發(fā)揮其促癌或抑癌功能[14,15]。如miR-27a可通過抑制MXI1或PHB的表達而促進或抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲[16,17]。目前尚未有研究報道m(xù)iR-27a對非小細胞肺癌生物行為學(xué)的影響。為了進一步闡明miR-27a在非小細胞肺癌中的發(fā)病機制，我們通過構(gòu)建miR-27a過表達A549穩(wěn)定細胞系，檢測miR-27a過表達對A549細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。結(jié)果顯示，miR-27a過表達后，細胞增殖活力和侵襲能力均受到顯著抑制，細胞凋亡率則明顯增加。動物體內(nèi)實驗也表明miR-27a過表達的裸鼠皮下移植瘤生長速度及其腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶水平均顯著低于對照組，提示過表達miR-27a可抑制非小細胞肺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究綜合細胞水平和動物水平實驗證明了miR-27a可通過下調(diào)GOLM1的蛋白表達，抑制非小細胞肺癌腫瘤細胞的增殖和侵襲，并促進癌細胞的凋亡，有望為非小細胞肺癌的臨床治療提供新的思路。但需要注意的是可能還存在其他靶基因受miR-27a的調(diào)控，進而抑制非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，這些工作還需未來更加深入的研究和探索。